源于内质网的钙信号调节顺铂诱导的人宫颈癌hela细胞凋亡

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1、前言前言顺铂是一种传统的化疗药物，也是妇科肿瘤的常用抗肿瘤药物之一，包括宫颈癌；顺铂在临床上可以单独使用，也可以和一些抗癌药物联合使用。然而，由于顺铂的副作用和机体对它的耐药性，顺铂在临床上的应用受到了限制。传统意义上认为，顺铂之所以能抗肿瘤是由于它能引起DNA损伤，进而诱发凋亡。DNA是顺铂主要的生物学靶点。顺铂中的铂原子在N7位置与嘌呤碱基以共价键结合，并以此形成在1,2和（或）1,3核苷酸链内交联及链间交联。这种链内及链间交联干扰了DNA的结构。DNA受到损伤后，细胞可以进行自身修复重新进入细胞周期，如若损伤不能被修复，则细胞开始发生凋亡。顺铂诱导

2、的特异性细胞损伤所激活的主要死亡途径是caspase依赖的内在的凋亡途径，包括线粒体凋亡途径和内质网凋亡途径。内质网是真核细胞内重要的细胞器之一，参与了多种细胞存活和功能发挥所必须的生物进程，如蛋白的折叠与分泌，脂质的合成以及维持细胞内钙稳态。当细胞受到外源性或内源性刺激时，内质网内大量未折叠或错误折叠蛋白堆积，启动防御性反应，即未折叠蛋白反应（UPR），内质网应激发生。在静息状态下，作为细胞内主要的钙库，内质网通过内质网腔上钙离子相关的膜通道调控钙的释放和摄入，维持一个钙震荡的平衡状态。一旦这种平衡被打破，就会激活下游的一系列信号通路。在以往的关于疾病

3、和肿瘤的研究认为，化疗药物可以引起细胞内的钙动员，通过靶向线粒体ROS代谢、ATP生成等过程，引发线粒体功能紊乱，导致细胞生长抑制和死亡。而作为与钙离子关系最为密切的内质网，钙信号在化疗药物引起的内质网来源的凋亡通路中的作用尚不清楚。因此，我们基于顺铂介导细胞死亡这一作用机理，以内质网内钙离子为切入点，深入探讨钙信号在线粒体依赖的凋亡途径及内质网来源的凋亡事件的作用机理，旨在进一步明确顺铂肿瘤杀伤机制，为增强其治疗调效应、调整联合用药策略减少耐药提供可能的理论依据。I中文摘要中文摘要源于内质网的钙信号调节顺铂诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡背景：顺铂是临床

4、上传统的抗肿瘤药物，也是妇科肿瘤最常用的化疗药物之一。然而，顺铂在治疗期间的副作用及其治疗抵抗限制了它在临床的应用，因此明确顺铂的细胞杀伤机制尤为重要。传统意义上认为，顺铂是通过损伤DNA和抑制DNA合成起到杀伤癌细胞的作用，这种作用引起了线粒体依赖的凋亡信号以及caspase相关的级联反应，最终导致细胞死亡。在以往的关于疾病和肿瘤的研究认为，化疗药物可以引起细胞内的钙动员，通过靶向线粒体ROS代谢、ATP生成等过程，引发线粒体功能紊乱，导致细胞生长抑制和死亡。与此同时，越来越多的证据显示，顺铂可以通过内质网应激触发相关的凋亡信号，导致细胞死亡。然而，作

5、为与钙离子关系最为密切的内质网，钙信号在化疗药物引起的内质网来源的凋亡通路中的作用尚不清楚。目的：明确顺铂对人宫颈癌HeLa细胞内钙离子的影响，探究内质网来源的钙信号在顺铂诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用，深入探讨顺铂可能的细胞杀伤机制。方法：1、用不同浓度的顺铂（2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL）处理HeLa细胞，分别作用0h、6h、12h和24h后，用荧光钙离子指示剂Fluo-4/AM和Rhod-2/AM孵育细胞，应用激光共聚焦显微镜分别检测细胞质和线粒体内钙离子浓度的变化；2、顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/A

6、M（2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞12h和24h小时后，用荧光钙离子指示剂Fluo-4/AM和Rhod-2/AM孵育细胞，应用激光共聚焦显微镜分别检测细胞质和线粒体内钙离子浓度的变化；II中文摘要3、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM（2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞24h后，应用MTT试验检测细胞活性；4、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM（2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa

7、细胞24h后，应用流式细胞术检测细胞凋亡；5、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM（2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞24h，应用荧光染料Hoechst33342着色细胞核，在激光共聚焦荧光显微镜下观察不同药物处理组细胞核的变化；6、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM（2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞12h后，应用蛋白质免疫印迹实验检测线粒体介导凋亡蛋白与内质网应激相关蛋白在HeLa细胞中的表达；7、顺铂单独处理

8、以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM（2.5μM）或IP