激活素a在鸡胚背根神经节发育过程中的作用

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1、激活素A在鸡胚背根神经节发育过程中的作用RoleofActivinAinDevelopmentofEmbryonicDorsalRootGangliaoftheChicken作者姓名：闫青专业名称：生理学指导教师：葛敬岩副教授学位类别：理学硕士答辩日期：2015年5月26日中文摘要激活素A在鸡胚背根神经节发育过程中的作用激活素A（ActivinA）属于转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）超家族的多功能生长和分化因子，分布广泛，在初期胚形成、神经细胞分化

2、发育、造血细胞增殖和分化、细胞凋亡及肿瘤发生发展、性激素分泌调节等方面发挥重要作用。其受体属于TGF-β超家族的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶型受体，由Ⅰ型和Ⅱ型受体组成。我们前期研究发现ActivinA具有促进鸡胚背根神经节（dorsalrootganglion,DRG）神经突起生长、维持神经元生存等作用，但其在DRG发育过程中的作用仍不清楚。因此，本研究通过分析不同日龄鸡胚DRG组织中ActivinA及其受体、信号传导蛋白Smads等的表达，探讨ActivinA与DRG发育的关系，并通过检

3、测神经元神经递质释放等，进一步分析ActivinA在DRG发育过程中的作用机制。一、实验方法体外培养8d鸡胚DRG，观察ActivinA及神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）对DRG神经突起生长的影响；选择不同日龄（8d、10d、12d、14d、16d、18d）的鸡胚DRG，通过逆转录PCR（reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR）、免疫组织化学染色等方法，分析ActivinA、激活素ⅡA型受体（activintyp

4、eIIAReceptor,ActRⅡA）以及激活素ⅡB型受体（ActivintypeⅡBReceptor,ActRⅡB）、信号传导蛋白Smads等在不同日龄鸡胚DRG中的表达情况；体外培养8d鸡胚DRG神经细胞，回收培养上清，酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）检测神经递质去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）等分泌水平。二、实验结果1.ActivinA促进鸡胚DRG神经

5、突起生长采用8d鸡胚，在解剖显微镜下直接分离DRG，接种48孔培养板，实验分为ActivinA组、ActivinA+抗NGF抗体组、ActivinA+FS组、NGF组、NGF+抗NGF抗体组和NGF+FS组，体外培养1~3d，每天观察鸡胚DRG神经突起生长情况。结I果显示ActivinA可以促进DRG神经突起生长，其作用不受抗NGF抗体影响，而抗NGF抗体则可阻断NGF促进的DRG神经突起生长。上述结果表明ActivinA促进DRG神经突起生长不依赖于内源性NGF。2.ActivinA及其受体、Sm

6、ads表达与鸡胚DRG发育的相关性为了探讨ActivinA在DRG发育过程中的作用，分别取不同日龄（8d、10d、12d、14d、16d、18d）鸡胚的DRG进行研究。RT-PCR检测结果显示，随着时间的推移，ActivinA及ActRⅡA、ActRⅡBmRNA表达量逐渐下降，而激活素结合蛋白FSmRNA表达量逐渐增加，激活素信号传导蛋白Smad3mRNA表达量逐渐降低，而Smad2mRNA表达量无明显变化。免疫组织化学染色显示ActivinA在鸡胚DRG神经细胞胞浆中表达，在8~12d表达量较高，

7、随着DRG的发育，在14d、16d、18d的表达逐渐降低，ActRⅡA及ActRⅡB与ActivinA表达相一致，而激活素结合蛋白FS随着时间的推移表达逐渐升高。免疫荧光化学染色显示ActRⅡA及神经元骨架蛋白MAP2在DRG神经元共表达，而且ActRⅡA也在12d的DRG神经元表达最高，随后逐渐下降，上述研究表明在鸡胚DRG的发育过程中，ActivinA可能参与了DRG早期发育过程，而随着DRG的发育，其作用逐渐减弱。3.ActivinA参与鸡胚DRG发育过程的可能机制分析采用体外培养8d鸡胚DR

8、G单细胞，通过甲苯胺蓝染色尼氏小体，研究发现ActivinA具有抑制DRG胶质细胞增殖的作用，而NGF不能有效抑制胶质细胞増殖。回收培养鸡胚DRG细胞上清，ELISA法检测神经递质5-HT、NE、DA、ACh、Glu、GABA的释放情况，结果显示ActivinA及NGF组5-HT、NE和GABA水平明显升高，统计学分析差异显著（p<0.05,p<0.01），而Glu水平则下降（p<0.05,p<0.01），但对DA、ACh的分泌无明显影响。RT-PCR检测结果显示，A