猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株的致弱评价与相关分子机制研究

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1、分类号：单位代码：密级号：博士学位论文猪繁殖与呼吸综合征局致病性毒株的致弱评价与相关分子机制研究研究生：刘灿指导教师：徐镔蕊教授合作指导教师：宁宜宝研究员申请学位门类级别：农学博士专业名称：基础兽医学研究方向：兽医病理学所在学院：动物医学院二零一五年六月ChinaAgriculturalUniversityPh.DDissertationEvaluationontheattenuatedhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandtheanalysisofasso

2、ciatedmolecularmechanismPh.DCandidate:LiuCanSupervisor:Prof.XuBinruiMajor:BasicVeterinaryMedicineBeijing,ChinaJune,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说

3、明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：办年月曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被査阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：时间：年月日中文摘要为了有效防控以促进生猪养殖行业的健康发展本研究从弱毒疫苗参考株的科学评价、的体外致弱分子机制的探寻以及

4、华北、华中与华南地区流行的分子特征与遗传进化规律的调查等三个方向进行了有益探索。首先，为了科学评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（株与株的传代致弱毒株、、与的安全性与免疫保护性，对接种不同毒株的仔猪从临床表现、增重、病毒血症与抗体水平进行了细致观察，在接种天后使用强毒株进行了攻毒保护试验，在进行临床观察的同时，定期剖杀各组仔猪观察大体病变，采取肺脏组织制备病理切片以观察显微病理损伤，应用免疫组化染色技术与荧光定量技术分别对肺脏与血清中的进行半定量与定量检测，应用方法检测了不同时间段各组动物血清中抗体水平。结果显示、与接种仔猪仍存在不同程度的病理损伤

5、，而接种仔猪与对照组仔猪均无明显病理变化，免疫组化与荧光定量检测结果显示、与的体内增殖速度明显快于，抗体检测结果显示在接种后天以及攻毒后均能提供仔猪更高抗体水平且具备良好的保护效果。综上所述，、与的致弱效果并不理想，而的安全性与免疫保护性达到了理想水平。其次，为了探索的体外致弱分子机制，分别比对分析了株传代至株的个中间代次毒株与株传代至株的个中间代次毒株的全基因序列与各蛋白氨基酸序列，发现株传代过程中共出现了个核苷酸变异，造成了个氨基酸变异，株传代过程中共出现了个核苷酸变异，造成了个氨基酸变异，但两者的不同点在于株的若干位点出现了反复变异的情况，而

6、株的变异位点则显得更为稳定，推测基因变异之后的稳定性与弱毒株的毒力返强风险存在较大关联。然后，将、与另外四对强毒株疫苗株（、、与的全基因序列与各蛋白氨基酸序列进行了比对分析，总结归纳出强毒株向弱毒株演化的各个蛋内中的共同变异氨基酸位点共个，推测其与的致病性相关。此外，将上述对强毒株致弱株与年间中国各地流行进行遗传进化分析，发现的两个主要分支都与弱毒疫苗株的同源性较高，推测在中国的广泛流行与高频率演化与弱毒疫苗的不合理使用有关，应在临床应用中引起重视。最后，从华北、华中与华南地区的临床病料中分离到株分别为株、株与株，这三株均属于北美型中的具有中的个氨

7、基酸缺失这一基因标志，此外，株的中存在个氨基酸插入为首次报道。将这三株新分离与其各属地区的历年分离毒株进行全基因序列与氨基酸序列比对分析以及遗传演化分析，结果表明华北与华南地区流行的分子多样性更为复杂，仅北美型毐株即可分为至少个亚型，说明在这些地区经历着高频率的变异，而对变异位点的分析提示我们其与弱毒疫苗的过度使用可能相关，因此需引起我们对于合理使用疫苗的重视。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；致弱；分子机制；遗传演化分析；流行病学AbstractInordertoeffectivelycontrolandpreventtheporcinereprodu

8、ctiveandrespiratorysyndrome(PRRS),soastoacceleratethedevelopm