鼠伤寒沙门菌spvb.spvc基因共同缺陷变异株的构建及spvb、spvc基因对中毒症状、免疫功能的影响

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1、分类号：密级：UDC：学号：416522712050南昌大学专业学位研究生学位论文鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷变异株的构建及spvB、spvC基因对中毒症状、免疫功能的影响ConstructionofspvB.spvCGene-DeletedMutantsinSalmonellaTyphimuriumanditsfunctiononSymptomsandimmuneResponse刘晓艳培养单位（院、系）：江西省儿童医院指导教师姓名、职称：陈强教授主任医师专业学位种类：临床医学专业领域名称：儿科学论文答辩日期：2015年5月答辩委员会

2、主席：吴星恒评阅人：陈晓胡龙华2015年5月学位论文独创性声明一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：刘晓艳签字日期：2015年5月27日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保

3、留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：刘晓艳导师签名（手写）：陈强签字日期：2015年5月27日签字日期：2015年5月27日鼠伤寒沙门菌sp

4、vB.spvC基因共同缺陷变异株的构论文题目建及spvB、spvC基因对中毒症状、免疫功能的影响姓名刘晓艳学号416522712050论文级别博士□硕士☑院/系/所南昌大学医学院专业儿科学联系电话E_mail通讯地址☑公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要目的：实验组前期已构建鼠伤寒沙门菌spvB/spvC基因缺陷株，故本研究仅构建鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株，并将野生菌株与这三株缺陷变异株感染小鼠，观察分析spvB/spvC基因对中毒症状、免疫调节功能的影响。为研究鼠伤寒沙门菌spvB/spvC毒力基因

5、的致病机制提供理论和实验依据，并为后续细胞实验进一步研究该基因的功能及疫苗的制备提供工具和手段。方法：1.同源重组法制备鼠伤寒沙门菌spvB.spvC基因共同缺陷株。在GeneBank数据库中查出鼠伤寒沙门菌毒力基因spv序列（包括spvABCD），给spvB、spvC设计两对特异性引物，并在引物的5’末端加上酶切位点，PCR法扩增spvB基因上游及spvC基因下游的核苷酸片段后，连接至自杀质粒pCVD442（pCVD442-ΔspvB.spvC）。再将pCVD442-ΔspvB.spvC入感受态细菌SM10λpir内，按接合++转移法使pCVD4

6、42-ΔspvB.spvC导入野生型鼠伤寒沙门菌211（spvB.spvC）中，随后蔗糖诱导同源重组。用PCR扩增来观察重组情况，将稳定的完全重组株认为是spvB.spvC基因共同缺陷变异株，并送基因测序鉴定。2.沙门菌spvB/spvC基因对中毒症状、免疫调节功能影响的研究。所有BALB/c小鼠均给予自由进食、饮水，室温（20℃-22℃），湿度（50%-55%）饲养。随机分为PBS组、野生型沙门菌211(Samonellatyphimurium，STM.211)组、敲除spvB基因的沙门菌（STM.211-ΔspvB）组、敲除spvC基因的沙门菌

7、（STM.211-ΔspvC）组和同时敲除spvB.spvC基因的沙门菌（STM.211-ΔspvB.spvC）组，每组25只。PBS组经腹腔注射（intraperitoneal，i.p.）0.2mlPBS，5其余各组分别注射0.2ml10CFU的STM.211、STM.211-ΔspvB、STM.211-ΔspvC、STM.211-ΔspvB.spvC。造模完成后观察小鼠精神状态、运动情况、腹泻、体重、毛发改变等感染中毒症状，于感染后1d、3d、5d、7d、9d，每组随机取5只小鼠摘眼球取血，用ELISA法测定血清IL-10、IL-12、IFN-

8、γ水平；并分离小鼠肝、脾，观察靶器官大体观及显微镜下的病理改变。II摘要结果：1.成功构建了稳定的鼠伤寒沙门菌spvB.s