nnk联合lps孵育对小鼠巨噬细胞的增殖及相关基因表达的影响

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1、分类号：R734.2密级：不保密UDC：61学校代码：11065硕士学位论文NNK联合LPS孵育对小鼠巨噬细胞的增殖及相关基因表达的影响陈琛指导教师刘晓萍教授学科专业名称细胞生物学论文答辩日期2015年5月31日摘要目的观察脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、4-（甲基亚硝氨基）-3-吡啶-1-丁酮（NNK）对小鼠巨噬细胞Raw264.7细胞增殖能力及C-myc、NF-κB、iNOS、Arginase、TNFα、IL-1α、IL-6基因表达的影响。方法体外培养小鼠巨噬细胞Raw

2、264.7细胞，用Realtime-PCR的方法检测不同浓度的LPS、NNK刺激Raw264.7细胞C-mycmRNA的表达情况，选择药物最佳浓度。利用细胞计数仪对比所选浓度LPS、NNK及LPS联合NNK不同孵育时间对Raw264.7细胞增殖能力的影响；Realtime-PCR方法检测C-myc及相关基因mRNA的表达情况；WesternBlot技术检测Raw264.7细胞中转录因子C-myc蛋白的表达情况；免疫细胞化学技术检测iNOS蛋白的表达情况；酶联免疫技术定量炎性介质TNF-a及IL-6

3、的含量。结果(1)浓度为10ng/ml、250ng/ml、1μg/ml和4μg/ml的LPS均可上调Raw264.7细胞的C-mycmRNA的相对表达量；1μg/mlLPS上调作用较其他组显著性增强(P<0.05）。浓度为5μM、10μM、25μM和100μM的NNK对Raw264.7细胞的C-mycmRNA表达影响有降低趋势，与对照组相比差异无显著性。（2）选择浓度为1μg/mlLPS+10μMNNK联合孵育Raw264.7细胞,可见24h及36hNNK联合LPS孵育组C-mycmRNA的相对表

4、达量较LPS组显著性降低（P24h<0.0001，P36h<0.05）。（3）LPS和LPS联合NNK孵育均可降低Raw264.7细胞的增殖活性（P<0.05），联合孵育48h的抑制作用较单独LPS孵育略强(P<0.05)。（4）LPS孵育24h、36h、48h均可显著刺激Raw264.7细胞NF-κB、Arginase、iNOSmRNA的表达。单独NNK孵育24h、36h、48h可见NF-κB、Arginase、iNOSmRNA相对表达量与对照相比无差异显著性。LPS联合NNK孵育24h、36h

5、NF-κB、Arginase、iNOSmRNA相对表达量升高；其中孵育24h、36h的NF-κB、孵育36h的iNOSmRNA表达量显著高于单独LPS刺激组（P<0.05）；LPS联合NNK孵育48h，ArginasemRNA表达量也升高，但低于单独LPS刺激组（P<0.01）。（5）LPS及LPS联合NNK孵育Raw264.7细胞24h，IL-1a及IL-6mRNA的表达较对照组明显升高，差异具有显著性（P<0.01）。LPS联合NNK组IL-1αmRNA表达量显著高于LPS组(P<0.05)。

6、（6）WesternBlot结果显示NNK、LPS、LPS联合NNK组孵育24h和48hC-myc蛋白表达量无明显变化。(7)免疫细胞化学结果显示LPS及LPS联合NNK孵育48h，iNOS蛋白表达量明显升高。（8）LPS和LPS联合NNK联合孵育Raw264.7细胞24h、48h，其IL-6、TNF-α蛋白表达均较对照组显著升高，LPS联合NNK孵育48hIL-6蛋白表达量高于LPS组（P<0.01），LPS联合NNK孵育24hTNF-α蛋白表量达低于LPS组（P<0.05）。结论NNK本身对巨

7、噬细胞的增殖、向M1型转化、转录因子的表达无明显作用。LPS可诱导巨噬细胞C-myc、NF-κB、iNOS、Arginase、IL-1a、IL-6mRNA的急剧升高，抑制该细胞的增殖、促其向M1型转化。LPS联合NNK联合孵育强化了LPS激活NF-κB、IL-1α等基因作用、弱化了Arginase基因的表达；进一步促进了M1型巨噬细胞的形成和激活，进而刺激M1细胞产生和分泌IL-1α、iNOS等，增加NO的合成；造成正常细胞DNA的损伤增加，阻碍DNA修复，诱导基因突变，刺激肺癌形成。硕士研究生：

8、陈琛(细胞生物学)导师：刘晓萍教授关键词：脂多糖；4-（甲基亚硝氨基）-3-吡啶-1-丁酮；细胞增殖；巨噬细胞EFFECTOFLPSANDNNKONTHEPROLIFERATIONANDRELATEDGENEEXPRESSIONOFRAW264.7CELLSAbstractObjectiveToobservetheeffectofLPSandNNKontheproliferationandC-mycgeneandotherrelatedgene(NF-κB、iNOS、Arginas