tim-3和th17细胞在免疫性肝损伤中作用及相关机制的研究

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1、分类号：R392.11密级：UDC：610学校代码：11065硕士学位论文Tim-3和Th17细胞在免疫性肝损伤中作用及相关机制的研究张文指导教师张蓓副教授学科专业名称免疫学论文答辩日期2015年5月30日摘要目的用刀豆蛋白A（ConA）建立免疫性肝损伤模型，探讨Tim-3和Th17细胞相关因子在发病过程中的动态变化及意义；靶向干预Tim-3通路后探讨其对Th17细胞的影响。方法60只Wistar雄性大鼠随机分为两组，即模型组（50只）和对照组（10只）。模型组大鼠尾静脉注射12.5mg/kgConA，每周1次连续8周。对照组大鼠

2、尾静脉注射无菌PBS，每周1次连续8周。随机从模型组中取10只大鼠，在第0周（0w）、第2周（2w）、第4周（4w）、第6周（6w）、第8周（8w）时对大鼠实施体外心尖取血1.5ml，分离血清后于-20℃备用。8周后随机从模型组中取出20只大鼠，酒精浸泡20分钟后无菌取脾制备脾淋巴细胞。在脾淋巴细胞中加入Tim-3的单克隆抗体来阻断Tim-3通路；用Tim-3的重组配体来激活Tim-3通路，37℃、5%CO2培养箱中培养72h，收集细胞上清液于-20℃保存。生化分析法测血清中ALT、AST和ALB的表达；HE染色观察肝脏组织的病理

3、变化；ELISA法测血清中Tim-3、IL-17A、IL-6、TGF-β和IL-23的表达及上清液中IL-17A和IL-6的表达；免疫组化法测肝脏组织中Tim-3、IL-17A和ROR-γt蛋白的表达；实时定量PCR测各组脾淋巴细胞ROR-γtmRNA的表达。结果与对照组相比，模型组大鼠的ALT及AST水平均显著升高(P<0.05)，ALB水平显著下降(P<0.05)。在模型组的不同阶段中，HE染色检测肝组织可见4w时开始偶见假小叶，6w时量明显增多，而8w时发现有明显的炎性细胞和肝脏损伤，镜下假小叶较多见；ELISA法检测相应的

4、细胞因子可见IL-17A、IL-6、IL-23的动态趋势是先升高，4w后开始降低(P<0.05)；Tim-3的动态趋势则是先降低，4w以后开始升高(P<0.05)；免疫组化检测相应的蛋白可见4w时IL-17A和ROR-γt蛋白的水平明显升高，而Tim-3蛋白的水平明显降低。靶向干预后，与阻断对照组相比，阻断实验组中IL-17A和IL-6的水平升高(P<0.05)；与激活对照组相比，激活实验组中IL-17A和IL-6的水平降低；实时定量PCR显示与阻断对照组相比，阻断实验组中ROR-γtmRNA的水平明显增加(P<0.05)。结论T

5、im-3及Th17细胞参与了免疫性肝损伤的发生发展，其水平的变化可以在一定程度上反应病情的严重程度，可望为免疫性肝损伤发生机制提供新的线索；免疫调控Tim-3通路可通过影响Th17细胞效应，进而影响肝损伤的程度，以期为临床治疗提供新的依据。硕士研究生张文（免疫学）指导教师张蓓副教授关键词：刀豆蛋白A；免疫性肝损伤；Tim-3；IL-17AAbstractObjectiveToestablishtheimmunologicalhepaticinjurymodelbyConAandinvestigatethedynamicchange

6、sofTim-3andTh17cellsassociatedcytokinesandexploretheeffectofinterventionTim-3pathwayonTh17cells.MethodsSixtymaleWistarratswererandomlydividedintomodelgroup(n=50)andcontrolgroup(n=10).Modelgroupwasivinjectedwith12.5mg/kgConAonceaweekforeightconsecutiveweekswhilecontrol

7、groupwasivinjectedwithPBSonceaweekforeightconsecutiveweeks.Taken1.5mlbloodbyapexcordisfrommodelgroupwithtaken10ratsrandomlyatthezero,thesecond,thefourth,thesixthandtheeighthweek,thenseparatedtheserumandstoredin-20℃.Taken20ratsrandomfromthemodelgroupandgotsterilespleen

8、sthenpreparedspleenlymphocytes.BlockingTim-3pathwaybyanti-Tim-3whileactivatingthispathwaybyrecombinantligand,cultured72hunde