七鳃鳗cd81的表达、抗体制备及相关功能的研究

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3、经撰写或发表过的研巧成果，其他同志的研究成果对本人的后示和所提供的巧助，均已在论文中做了明确的声明并表示巧意．学位论文作者签名：学位论文版权的使用授极书权本学位论文作者完全了解迁宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有保留并向国家有关部口或机构送交复印件或磁盘，入允许论文被査阅和借阅。本文授权迂宁师范大学，可ｌｉｉｌ将学位论文的全部或部分内容编有关数据库并进行检索，可从采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本投权书。学位论文作者签名；

4、疏忘指导教师签名：签名日期：年１月＾日７分类号：学校代码：10165密级：学号：201311001068硕士学位论文七鳃鳗CD81的表达、抗体制备及相关功能的研究作者姓名：宋雪萤学科、专业：细胞生物学研究方向：免疫分化调控导师姓名：刘欣教授2016年4月辽宁师范大学硕士学位论文摘要CD81属于四跨膜蛋白超家族，广泛表达于细胞表面，是细胞内外信号传递的重要桥梁。CD81以分子复合物的形式存在与B细胞表面，在T细胞表面与CD4和CD8相关，CD81参与形成免疫突触，在适应性免疫和先天免疫中都起到重要的作用。因CD81具有HCV-E2的结合位点，而成为HCV的

5、受体，进而成为研究HCV的靶向位点，为预防和诊疗提供科学依据。目前，针对CD81的研究主要局限于高等脊椎动物，而在古老的脊椎动物中研究甚少。七鳃鳗作为无颌类脊椎动物，一直被看作是研究低等脊椎动物的重要生物。因在幼体七鳃鳗中发现了可变淋巴受体VLRs（VLRA、VLRB、VLRC）的存在更受到广泛关注，可变淋巴受体可能是适应性免疫的起源。因此，研究七鳃鳗体内的CD81对于探讨七鳃鳗免疫应答相关过程具有重要意义。本文中，因蛋白酶切和纯化需要，将表达载体pColdTF进行改造，利用多点突变的方法将载体上原有的His标签替换掉，在七鳃鳗体内克隆得到的Lja-CD81的OR

6、F区的3’端重新添加His标签。并成功将Lja-CD81亚克隆到改造后的表达载体pColdTF上，进行可溶蛋白的诱导表达。通过FactorXa蛋白酶，酶切纯化得到的连有表达载体的Lja-CD81蛋白，而得到不含助溶标签（TF）的Lja-CD81蛋白。通过抗原设计软件，选取合适的多肽制备多克隆抗体。利用Westernblot方法，检测Lja-CD81在七鳃鳗白细胞、髓样小体和鳃等组织中的表达情况。利用免疫荧光观察Lja-CD81在单个核白细胞中的定位情况，并比较对照组和免疫刺激组中Lja-CD81的定位变化。同时结合流式细胞术观察Lja-CD81和可变淋巴受体VLR

7、s在免疫刺激前后的表达量以及共定位情况。最后，利用免疫沉淀，试图寻求在七鳃鳗白细胞、髓样小体和鳃的总蛋白中与Lja-CD81相互作用的蛋白。结果表明，Lja-CD81在加强免疫第三天的白细胞和髓样小体中表达量明显升高。针对免疫相关组织，分时间点加强免疫刺激时发现在白细胞和鳃中加强免疫12h的表达量较高，在髓样小体中，加强免疫18h的表达量较高。说明Lja-CD81可能参与相关免疫系统的免疫应答过程而表达量升高。免疫荧光结果表明CD81定位于细胞膜上，在免疫刺激后出现不均匀表达的极化现象，可能与在七鳃鳗体内形成类似于免疫突触的结构有关。且Lja-CD81与VLRs的

8、共定位比例