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《chifn-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、云南大学学报(自然科学版),2008,30(6):630～635CN53-1045/NISSN0258-7971JournalofYunnanUniversityChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达1,21,221吴拥军,赵德刚,宋莉,许文钊(1.贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;2.贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025)摘要:为了使鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应
2、用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒pSH中构建成植物表达载体pSH-NGN.经生菜瞬时表达,ELISA检测表明ChIFN-γ蛋白获得有效表达.研究结果为进一步遗传转化油菜奠定了基础,同时也对构建基因的正确表达提供了一种新的快速鉴定方法.关键词:ChIFN-γ;同尾酶;构建;瞬时表达中图分类号:Q786文献标识码:A文章编号:0258-7971(2008)06-0630-06干扰素(Interferon,IFN)是一类具有广泛生物学生产成本低、生产量大,通过添加入饲料或直接作活性
3、的糖蛋白,由英国科学家Isaacs和瑞士研究人为口服疫苗喂养家禽,从而达到预防治疗作[6～8]员Lindenmann于1957年在研究流感病毒干扰现象用.时,在鸡胚绒毛尿囊膜发现.它具有较强的免疫调利用Genbank数据库登录的ChIFN-γ序节、广谱抗病毒、抗寄生虫和抗肿瘤等多种重要的生列,依据油菜中使用频率最高的密码子优化[1,2]理功用,在疫病防治的研究中受到广泛关注.ChIFN-γ,人工合成包含Kozark序列和内质网我国养鸡业历史悠久,无论是鸡的品种资源、滞留信号肽SEKDEL的ChIFN-γ基因,利用同肉蛋制品和生产数量
4、均名列世界第一.但由于病毒尾酶连接法构建含有油菜种子特异性启动子变异快,造成疫苗免疫失效,且新的病毒病不断产Napin,ChIFN-γ及NOS终止子表达盒的pSH生,难以控制,特别是全球高致病性禽流感疫情频-NGN植物表达载体.采用根癌农杆菌EHA105[3]发,每年由病毒病造成的损失约上百亿元.研究真空渗透法在生菜中瞬时表达,ELISA检测表达表明IFN可通过喉部黏膜吸收,较少分子IFN就的ChIFN-γ蛋白.研究诣在通过同尾酶构建有效可产生很强的免疫应答.由于干扰素不会出现耐药的植物表达载体,瞬时表达验证ChIFN-γ蛋白能性,
5、对许多病原微生物具有有效的抑制和防御功否正确表达,为pSH-NGN/EHA105遗传转化油能,特别是γ-干扰素具有广谱抗病毒活性和免疫菜,开发ChIFN-γ植物口服疫苗奠定基础.保护作用,而重组干扰素与天然干扰素又具有同样1材料与方法的抗病毒和免疫调节的活性,因此在生产上有实际[4,5]的应用意义.但目前对ChIFN-γ表达方面研1.1材料究较少,且主要以原核细胞表达包涵体为主,后处1.1.1植物材料生菜购自贵阳市花溪农贸市理工艺繁琐,导致干扰素活性较低,生产成本较高.场.而利用转基因植物生产ChIFN-γ具有表达产物1.1.2菌株
6、及质粒质粒pSH,E.coliTG1,A-无需处理就具有生物活性,植物籽实可长期贮存、grobacteriumtumefaciensstrainEHA105均为本室收稿日期:2008-04-30基金项目:国家科技支撑计划项目资助(2007BAD59B06);中国国际合作项目资助(2007DFA31260);贵州省优秀青年科技基金项目资助(20030312).作者简介:吴拥军,男,河南人,博士生,副教授,主要从事植物基因工程方面的研究.通讯作者:赵德刚,男,贵州人,教授,博士生导师,院长,主要从事植物基因工程方面研究,Email:de
7、gangzhao@yahoo.com.第6期吴拥军等:ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达631保存.1.2.6瞬时表达浸染液的制备接种5%的pSH1.1.3主要试剂TaKaRaAgaroseGelDNAPu--NGN/EHA105至含有抗生素的YEB培养基(酵rificationKitVer.2.0,TaKaRaMiniBESTPlasmid母抽提物0.6%,胰蛋白胨0.5%,蔗糖0.5%,硫PurificationKitVer.2.0,DNAMarker为宝生物工酸镁2mmol/L,卡那霉素50mg/L,利福平20程(
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