云南萝芙木pnae基因转录分析及原核表达

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1、分类号：密级：学校代号：１０５３８学号：２２００８３３７？劣弁裝卡４辛ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ硕±学术学位论文云南萝芙木公基因转录分析及原核表达作者姓名：李雅娟导师姓名：曹福祥培养学院：生命科学院学科名称：生物化学与分子生物学研究方向：生物制药提交日期：２０１５年５月Ｔ＊ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｉｅｉｓｓｉｏｎｏｆ戶怎ＧｅｎｅｉｎＲａｕｖｏｌｊｉａｙｕｎｎａｎｅ

2、ｎｓｉｓＴｓｉａｎｂｙｇＢｙｌｉＹａｕａｎｊＡ化ｅｓｉｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎａｒｔｉａｌ扣ＩｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＳｃｉｅｎｃｅＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｒｏｆｅｓｓｏｒＣａｏＦｕｘｉａｎｇＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４９８ＳｈａｏｓｈａｎＳｏｕｔｈ民ｏａｄ，ＴＴｉａｎｘｉｎＤｉｓｔｒｉｃｔＣｈａｎｓｈａＨｕｎａｎ４１０００４Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡｇ，Ｊ

3、ｕｎｅ，２０１５中南＃皮种我夫缘学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果，。除了文中特别加标注引用的内容外本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料，均。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体已在文中Ｗ明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：年月Ａ曰＾中斋妹史种我夫營学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部

4、口或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于；１□，在年解密后适用本授权书。、保密２、不保密口。＂＂（请您在Ｗ上相应方框打Ｖ）心＾作者签名：导誰名：年Ｖ月皆日公摘要云南萝芙木诉ｆｌｙｉｍｎａｗｅｎｓｂＴｓｉａｎｇ）因其含有多种功能的生物碱而被广泛应用于药物提取。近年来随着萝芙木药用价值的不断开发，其资源被迅速消耗，再生速度远跟不上消耗速度。为了提高云南萝芙木的资源利

5、用率，研究其重要生物碱的代谢途径大有必要。ａｍａ一ｌｉｎｅ）是在舌南萝芙木的药用成分中，阿吗灵（其中个重要的生物碱，ｊ聚精液素醇酷酶ＰＮＡＥ（ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｄｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅｅｓｔｅｒａｓｅ）则是阿吗灵合成途经中的关键酶。巧心￡基因的表达调控模式可能与阿吗灵的生成具有重要联系。本论文在云南萝芙木中对户化４￡基因进行转录水平分析，同时在体外进巧原核表达研究，为后期深入研究ＰＮＡＥ蛋白酶在阿吗灵合成途径中的功能奠定基础。本研究主要内容如下；１）云南萝芙木外植体脱毒及组织培养条件研究。２）戶撕４￡基因克隆及序列分析。云南萝芙木成年植株叶片为原

6、料提取ＲＮＡ、－ＰＣＲ扩增ＰＮＡＥ基因片段反转录、ＲＴ。纯化ＰＣＲ产物之后进行ＴＡ克隆，获得７９５ｂｐ扩增片段。进行生物信息学分析，预测ＰＮＡＥ蛋白酶的二级结构。分析结果表明该蛋白有２６５个氨基酸组成，ａａ螺旋、Ｐ转角是该蛋白质整体结构中的主要元件，ａ螺旋散布于整个蛋白质中，且该蛋白属于亲水性蛋白。＞３）分析云南萝芙木不同组织中／％４￡基因的表达丰度。根据基因序列设计引物，选用１８ｓＲＮＡ作为内参基因，选取成年云南萝芙木植株根、茎、老叶、嫩叶、花５个不同组织，组培幼苗根、茎、叶３个組织部位分别作为样本进行相对定量分析，研究其在不同姐织中的表达情况。化较数

7、据出到结论；ＰＮＡＥ基因在成年植。株各个组织部位中表达并无明显差异，在组培幼苗中同样无明显差异４）ＰＮＡＥ酶的原核表达。构建原核表达载体ＰＮＡＥ，对酶的原核表达条件进行了初步探索。对培养基的成分、苗的种龄、茜液的接种量、摇瓶装液量、振荡器转速、诱导剂ＩＰＴＧ浓度、诱导时机、诱导时间、培养与诱导温度等进行尝试，－－获得高效表达重组ＰＮＡＥ蛋白的诱导条件：ＰＧＥＸ６Ｐ１为表达载体，ＢＬ２１为表°达菌株，３７Ｃ，