小鼠lewis肺癌靶向性免疫基因治疗的实验研究

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1、中巧分类号７３－３６＋２：ＲＳＫＩＨＵＡＮＭＥＤＩＴＹＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳ硕±学位论文Ｗ小鼠Ｌｅｗｉｓ巧癌巧向巧免疫基因治巧的实验研巧院（系）、巧临床医学院研妃半＿姓《刘窩华学科、专业外科学見肺巧免唐小至副教挖＇■二〇—五年四月目录小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌鞭向性免疫基因治疗的实验研究１中文摘要１英文摘要４前Ｂ８一第部分小鼠ＴＥＲＴ启动子（ｍＴＥＲ巧）的克隆及其在肺癌中转录活性的检测１１小鼠ＴＥ民Ｔ启动子（ｍＴＥＲＴ）的克隆及鉴定

2、１１ｐ实验材料及主要实验仪器１１实验方法１２实验结果１６ｍＴＥＲＴ后动子在不同细胞中转录活性的检１９实验材料及主要实验仪器１９实验方法２０实验结果２２扣结２３■？．１第二部分结核杆菌抗原Ａｇ８５Ａ－Ａｇ８５Ｂ基因表达慢病毒质粒构建及病毒包装２４慢病毒质粒构建２４实验材料及主要实验仪器２４实验方法２５实验结果２９慢病毒包装、感染及目的基因表达的检测３６实验材料及主要实验仪器３６实验方法３７实验结果４０＾４１

3、第王部分ｍＴＥＲＴ启动子调控Ａ８５Ａ－Ａ８５Ｂ双基因慢病毒对小鼠ｇｇＬｅｗｉｓ肺癌的杀伤的体内实验４３实验材料及主要实验仪器４３实验方＆４４实验结果４６小结５０讨论５１全文结论５７参考文献５８英没缩略词对照表６６致谢６７ＮＳＣＬＣ的免疫治疗６８四川医科大学硕±学位论文小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌铅向性免疫基因治巧的实验研究摘要研究背景与目的：肺癌已经成为对人类生命和健康威胁最大的头号癌症杀手，尽管过去的数十年间，手术、放巧和化疗等传统治疗不断取得

4、进展，但目前肺癌的治疗效果仍不理想。免疫基因治疗是近年来肿瘤研究的热点一领域之，也是有望改善目前肺癌治巧现状的新方法而备受期待。引入外源性抗原基因，使肿瘤细胞表达外源性抗原，激活宿主的主动免疫，是免疫基因治疗的重要策略。多项研究展示了送种方法的可行性。然而，机体的免疫机制十分复杂，过度或广泛的免疫反应将导致严重的免疫相关性疾病。因此，肿瘤免疫基因治疗理想结果应该是治疗效应具有高度肿瘤祀向。性，即免疫反应局限在肿瘤局部用肿瘤特异性启动子对目的基因的表达一进行转录调控是靴向性基因治疗的基本方法之。端

5、粒酶催化亚单位ＱｅｌｏｍｅｒａｓｅｃａｔａｌｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔＴＥ民Ｔ）启动子的转录活性具有肿瘤特异性ｙ，高，适用范围广泛的特点，成为肿瘤祀向性基因治疗研究中应用最广泛的的基因转录调控元件。本课题旨在探索小鼠ＴＥＲＴ启动子作为基因转录调控元件，结核杆菌抗原基因Ａｇ８５Ａ和Ａｇ８５Ｂ为治疗基因的肺癌祀向性免疫基因治疗的可行性和具体途径。方法；１．小鼠基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣ民方法克隆小鼠端粒酶催化亚单位启动子（ｍＴＥ民巧）活性片段，并将ｍＴＥＲＴ启动子插入焚光素酶报ＧＬ３－ｂａｓｍ巧民

6、Ｔ告质粒ｐｉｃ，构建ｐ调控的英光素酶报告质粒ＧＬ３－ｍＴＥ民Ｔｃ，然后用ＬｕｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａ检巧！ｍＴＥＲＴｉｓ月ｐｐｙＪ在小鼠Ｌｅｗ市癌ｐ１本课题受国家自然科学基金资助（批准号：８１７２２３７）和四川省科技厅支撑项目资助（肺癌视向性免疫基巧治疗的实验研究）－１－四川医科大学硕±学位论文细胞、小鼠成纤维细胞Ｎ阻３Ｔ３、人肺腺癌细胞株Ａ５４９、人食管癌细胞株ＥＣ－１０９Ｍ艮Ｃ－５中２和正常人化肺成纤维细的转录活性；．化学合成结核杆－－－８５Ａ和Ａ８５Ｂ８５ＡＭＹＣＰ２Ａ－

7、Ａ８５ＢＨＡ菌抗原Ａｇｇ双基因序列Ａｇｇ，其中Ｍｃ和ＨＡ为柄签序列，便于后续实验中对Ａ８５Ａ和Ａ８５Ｂ蛋白表达进ｙｇｇ行检测；Ｐ２Ａ为口蹄疫病毒连接序列，将Ａｇ８５Ａ和Ａｇ８５Ｂ连接起来，构一－－－－建到同载体中，各自独立表达。将Ａｇ８５ＡＭＹＣＰ２ＡＡｇ８５ＢＨＡ序列克－－ＬＶＸ－ＥＧＦＰ３ＦＬＡＧＰｕｒｏ中隆到慢病毒质粒Ｐ，构建成ＣＭＶ启动子驱动的Ａ８５Ａ－Ａ８５Ｂ慢病毒表达质粒ＬＶＸ－Ａ８５Ａ－Ａ８５Ｂ－ＣＭＶｇｇｐｇｇ；利用核酸分子克隆技术用ｍＴＥＲＴｐ取代ｐＬＶＸ－Ａｇ８５Ａ－Ａｇ８５Ｂ－Ｃ

8、ＭＶ中的ＣＭＶ启动ｍＴＥ民Ｔ－子，构建ｐ驱动的Ａｇ８５ＡＡｇ８５Ｂ双基因慢病毒质粒ＬＶＸ－８５Ａ－－Ａ８５Ｂ－ｍＴＥ民Ｔ８５Ａ－ＡｐＡｇＭＹＣｇｐ；３．用构建的两种Ａｇｇ８５Ｂ慢病毒质粒分别包装慢病毒，感染Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞和小鼠成纤维细胞Ｎ阳３Ｔ３，用