毛竹萜类合成酶基因tpss的克隆、表达与功能研究

《毛竹萜类合成酶基因tpss的克隆、表达与功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号Ｑ９４８．１密缀公立ＵＤＣ学位论文毛竹磅类合成酶基因７７诚的克隆、表达与功能研究Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｓｏｂａｍｂｏｏｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ（ＴＰＳｓ）陈香指导教师姓名汤锋教授￣申请学位级别博去￣专业名称生态学研究方向植物化学－￣￣论文提交日期２０１５年５月论文答辩日期２０１５年６月—学位授予日期２０１５年７月答辩委员会主席张宏巧评阅人北成？中齒林业科

2、学研究院中国蛛《种锋却《讼学位论文毛竹酷类合成酶基因７Ｐ况的克隆、表达与功能研究学位论文作者指导教师姓名汤锋教授指导小组成员岳永德教授王进副研究貢孙背支副研究员申请学位级别博壬专业名称生态学研究方向植物化学论文答辩日期２０１５年６月１９曰中国？北京ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＤｅｒｅｅｇＣｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｓｏｂａｍｂｏｏｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ（ＴＰＳｓ）Ｃａｎｄｉｄａ

3、ｔｅ：ＸｉａｎＣｈｅｎｇｕｒｖｒ：ａｎＳｅｉｓｏＦｅｎＴＡｐｇｇｓｓｏｃｉａ化Ｓｕｅｒｖｉｓｏｒ：ＹｏｎｄｅＹｕｅｐｇＪｉｎＷａｎｇｉａＳｕｎＪｃａｅｍｉｃＤｅｒｅｅｌｅｄｏｒ：化．Ｄ．ＡｄＡｉｆｇｐｐＳｅｃｉａｌｉｔ：ＥｃｏｌｏｐｙｇｙＤａｅｏＤｅｅｎｃｅ：ｔｆｆ２０１５．０６．１９－－Ｄｅｒｅｅｃｏｎ化ｒｒｉｎｉｎｔｉｔｕｔｉｎＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｏｆＦｏｒｅｓｔｒｓｏ：ｇｙｙｇ摘要萜类是自然界存在的一类由异戊二烯为结构单元的化合物的总称，是迄今所发现的植物次生代谢物中最大的一个家族

4、，具有多种化学生态学效应，如植物花香挥发物的主要成分之一就是萜烯类化合物，可作为重要的表达信号来引诱昆虫进行授粉和受精；同时当植物受到昆虫侵袭时，会释放大量的挥发性萜类，用于吸引昆虫的天敌而使自身免受伤害。此外，萜类化合物在植物与植食性昆虫以及病原菌互作中发挥重要作用，直接或间接参与植物的防御反应。毛竹（Phyllostachysedulis）是禾本科植物中最具有代表性的林业资源，也是竹亚科中最具生态和经济价值的物种，同时由于其分布广泛、经济价值高、加工产品丰富等特点，因而被广大研究人员作为竹亚科模式植物进行研究。毛竹基因组数据库已于2013年完成测序，但其中大多数基因

5、的功能尚不清楚，而本文则利用分子生物学手段旨在从毛竹基因组中分离出萜类合成酶的相关基因（MoTPS），获取完整的各基因编码序列，再分别采用原核表达和真核表达系统获得MoTPS高效表达的工程菌，然后对各融合蛋白进行分离和纯化，并进一步鉴定其功能。该项研究对阐明毛竹萜类代谢途径及其关键酶的功能具有重要意义，同时也为萜类的工业化发酵生产提供借鉴和改造靶点。本文的主要研究结果如下：1.基于毛竹基因组数据信息，通过KEGG注释从中筛选出潜在的萜类合成酶基因共15条，命名为MoTPS1-15。通过构建进化树分析发现其中有8条基因（MoTPS1-8）归属于Tpsa亚族，负责编码倍半萜

6、和二萜合成酶基因，有4条基因（MoTPS10-12/14）归属于Tpsb亚族，负责编码单萜合成酶，MoTPS13属于Tpsg亚族，而MoTPS9和MoTPS15则不属于任何已知的萜类合成酶家族。对这15条基因编码的蛋白进行定位分析，发现其大多数存在于胞质中，少部分位于叶绿体中，与植物体内的两条萜类生物合成途径相呼应。实验过程中通过梯度PCR改变退火温度，并使用不同的毛竹组织样品为扩增模板，成功获得8条基因的完整序列，分别为MoTPS2/3/5/6/11-14，其中MoTPS12和MoTPS13这2条基因由于可变剪接方式的不同而产生两个转录本，分别标记为MoTPS12S和

7、MoTPS13S。I2.原核表达体系采用了5种表达载体，分别为pGEX4T-1、pET30a(+)、pET32a(+)、pET28a-sumo和pColdI-sumo载体，将上述10条基因经合适的限制酶处理后分别与载体连接，成功构建出pGEX4T-1-MoTPS2/12/12S/13/13S、pET30a-MoTPS2、pET32a-MoTPS2/12/12S/13/13S、pET28a-sumo-MoTPS2/5/6和pColdI-sumo-MoTPS2/5/6/14共18种原核表达重组质粒，随后将其分别转化到不同的大肠杆菌株系中进行表