婴儿生后粪便微生物区系的演变

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1、授予单位代码10089学号或申请号20122232HebeiMedicalUniversity硕士学位论文科学学位婴儿生后粪便微生物区系的演变研究生：魏向倩导师：张琳教授专业：儿科学二级学院：第三医院2015年3月河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产

2、权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名导师签章:^f二级学院领•？邊f河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名:导师签章：W^c录中文摘要1英文摘要5英文缩写9研究论文婴儿生后粪便微生物区系的演变前言10材料与方法11会課16闘21赚29i寸i仓31制仓36参考文献36综述肠道菌群的定植模式与远期过敏性疾病的发生风险

3、39雜47个人简历48中文摘要婴儿生后粪便微生物区系的演变摘要目的：肠道微生物在营养代谢、免疫系统成熟以及促进肠粘膜屏障的完善中起重要作用，肠道微生物群多样性或结构的改变与多种疾病有关，婴儿时期是肠道微生物群定植、演替的重要阶段，婴儿时期肠道微生物群定植模式可持续至成年。以往对于肠道微生态的研究多采用培养或分子生物学技术，对于肠道微生物群的多样性研究有明显的局限性，随着第二代高通量测序技术的出现，以其测序快、准确度高等特点逐渐应用于肠道微生物的研究，这些研究大多在欧美国家完成，中国此方面文献报道不多，且样本量少，结果差异性较

4、大，不能全面体现婴儿肠道微生物区系的定植及演变全过程。本研究旨在通过IlluminaMiseq高通量测序平台对婴儿多个时间段的粪便微生物群进行DNA测序，探讨婴儿生后粪便微生物区系的定植和演变过程，为今后肠道微生物群系变化与远期疾病的发生风险提供理论依据。方法：选择2013年11月-2015年3月在河北医科大学第三医院和石家庄市第四人民医院出生的符合入组标准的新生儿30例，均为阴道分娩、母乳喂养、家中成员无过敏史，母亲围产期未应用抗生素，婴儿及其双亲均生活在石家庄市或其周边县市，气候环境，居住环境，饮食环境等相当。收集其婴儿

5、出生后第1、3、7天，第1个月、3个月和第6个月龄时的粪便标本（分别设定为A-F组）,冻存于-80℃冰箱，并随访入组婴儿上述时间段的喂养状况、健康情况及用药情况(抗生素及益生菌制剂)。采用OMEGAE.Z.N.A试剂盒提取粪便标本中DNA，通过IllminaMiseqPE250高通量测序平台对细菌16SrRNA的V3-V4可变区域进行测序，应用Mothur软件对测得序列进行OTU聚类，分析肠道菌群的丰度及多样性，在门及属水平对婴儿生后肠道微生物区系进行详细描述，并结合随访情况，分析出现变异原因。结果：1入组婴儿30例，收集其

6、婴儿出生后第1、3、7天，第1个月、3个月和第6个月龄时的粪便标本，应收集标本180份标本，但实际收集1581中文摘要个标本，因各种原因脱落22个，脱落率为12%。其中15个粪便标本提取DNA失败，11个标本扩增失败，共计132个粪便标本进入测序程序，测得总序列5143376，总碱基数3096312352bp，经过滤及筛选后，共获得优化序列为2717040，总碱基数为1206679948bp，平均长度444.12bp。2对测得序列进行随机抽样，以抽到的序列数与所代表OTU的数目构建稀释曲线，此曲线趋于平坦，说明所测序数据量合

7、理，测序深度足够，能覆盖肠道菌群97%的菌种。通过Chao1指数、ACE指数随着时间的推移逐渐增大，显示粪便微生物丰度逐渐增多，Shannon指数逐渐增大、Simpson指数逐渐减小提示生后随时间推移，粪便样本中菌群多样性逐渐增加。3对132个粪便标本进行测序，共测得17个门，181个属。其中在门水平上，占微生物区系99%的有5个门，分别为Proteobacteria（变形菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）Bacteroidetes（拟杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）Fusobacteria（梭菌门）

8、。主要属包括：Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Lactococcus（乳球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Enterococcus(肠球菌属）、Escherichia-Shigella（大肠埃希菌-志贺菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）Klebs