人胚胎干细胞培养手册

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1、操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi4×106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。培养条件：温度：37±0.5℃CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100%主要技术：1．细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通

2、过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。3．细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2µm的滤

3、膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。MEF培养液：hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜,0.2µm的滤膜过滤,4℃保存。明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2µm的滤膜过滤。明胶包被：接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被

4、35mm或10cm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。准备MEF：可靠的MEF对hESCs的生长和存活是非常重要的。每管含4×106PMEFi，可接种一块六孔板。在复苏/传代hESCs前一到二天接种PMEFi，MEFs超过12－14天不能再用作滋养层。种植MEFs：37℃预温MEF培养液，吸10ml到15ml无菌离心管中。从-80℃取出MEF冷冻管，立即沁入37℃水浴中，大约30－45秒，细胞有80％融化时取出，立即拿进超净台，70％异丙醇消毒。把细胞加有培养液的离心管中，最好用1ml培养液冲洗冻存管，也加到离心

5、管中。500－600g，离心5分钟。离心同时，从培养皿中吸出明胶，离心后，小心弃去上清，用12ml（6个孔）培养液重悬细胞，充分混匀，每孔加入2ml。标记MEF皿，37℃过夜，让MEF贴壁。6小时后细胞贴壁，最好在接种24－48小时使用，不要使用超过4天的MEF.hESdells所得到的hEScells在10cm培养长满后，分装6瓶，密度4×105cells/ml—对于绝大多数冷冻管。HUES-9为0.5ml，复苏时时间要比其系短一些。建议每管复苏到一个35mm培养皿中，或6孔皿的一个孔。复苏1.接种hES细胞：

6、复苏前应确保MEF已经被准备好且状态良好，不要应用MEF状态不好或超过3天的皿，建议事先标记好所有的离心管和培养皿。预温hES培养液到37℃，一个细胞系吸取10mlhES培养液到无菌的和标好的15ml离心管中，从液氮中取出hES冷冻管，立即将冷冻管的下半部浸入37℃水浴中，大约45~60秒，细胞80%融化时从水浴中取出，立即将冷冻管拿到超净台中，70%酒精消毒，轻轻移入10ml预温培养基中。建议用1ml预温培养液洗冷冻管后一并移入15ml离心管500~600g，5min，离心时，从培养箱中取出MEFS，在超净台里

7、吸出培养液（需要几个孔吸几个孔），立即加入1mlhES培养液，小心不要碰到MEFS，将其放置在超净台内，离心完后，小心吸出培养液，不要碰触离下来的细胞团（如有必要不要吸出所有的培养液。用1ml培养液轻轻重悬细胞团，将1mlhES溶液轻轻滴加到预先加入1mlhES培养液的MEF上，和MEF一样尽管使其均匀分布在培养皿上，轻轻移入培养箱，37℃过夜，让hES接种到MEFS上。hES细胞培养hES细胞培养是费力的，除了复苏/传代的之外，培养液应该每天被更换。此外，复苏或传代之后经常出现生长滞后现象。因此，每天观察细胞非

8、常重要，必须保证提前两天准备MEF，因为传代的时间可能会超出你的预期。请注意，我们已经观察到在这些HUES细胞系，染色体的改变包括12三体（在两个细胞系：hVES-3和4）和其它改变（HUES-12号染色体增加）。这些染色体的异常与增殖特点和双链期短等有关。由于染色体异常在hES细胞系中是普遍的，建议经常进行染色体分析。Day1hES细胞复苏24h后，4倍光镜观察，能看到