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1、猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测116养猪SWINEPRODUCTIONf512011猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测薛原,陈建飞,张秀英,赵树臣,田丽红,张彦龙(1.东北林业大学野生动物资源学院,黑龙江哈尔滨150040;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,哈尔滨150001;3.东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150040)中图分类号:$852.61+4文献标志码:A文章编号:1002—1957(2011)05—0116—03摘要:为指导临床合理用药,根据耐药表型和基因型研究耐氨基
2、糖苷类药物猪源大肠杆菌的流行情况,采用K—B法检测大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性,同时用PCR技术扩增氨基糖苷类药物的耐药基因以明确其基因型.结果显示,60株临床分离菌中,耐氨基糖苷类抗生素菌株54株,耐药率为90%;aac(3)一I基因PCR扩增均为阴性;aac(3)一Ⅱ基因检出阳性28例,阳性率为46.7%;aac(6)一I基因检出阳性54例,阳性率为90%.结果表明,耐氨基糖苷类药物的大肠杆菌比较普遍,氨基糖苷类耐药基因以aac(3)一II和aac(6)一I为主.关键词:大肠杆菌;氨基糖苷类;耐药性氨基糖苷类抗生素是一类
3、作用于细菌核糖体,抑制其蛋白质合成的抗菌药物.由于其具有广谱,高效,优良的抗生素后效应及与B一内酰胺类协同作用等特点,因此成为临床上抗革兰氏阴性菌感染的重要药物lll.其耐药机制主要包括细菌细胞膜通透性改变,细菌的主动外排,靶位点的改变及钝化酶的产生,其中最主要的为钝化酶的产生.钝化酶主要有氨基糖苷乙酰基转移酶(AAC),氨基糖苷基磷酸转移酶(APH),氨基糖苷核苷转移酶(ANT),目前已发现的有30多种.氨基糖苷类药物修饰酶通常由质粒和染色体所编码.不同的氨基糖苷类抗生素可为同一种酶所钝化,而同一种氨基糖苷类抗生素又可为多种钝
4、化酶所钝化,这是因为一种抗生素的分子结构中可能存在多个结合点的关系.相同基因型可能对应不同的耐药表型,这些细菌可能是实际的基因表达水平不同,也可能是药物代谢速度上有所差异.1试验材料1.1试验菌株药敏质控菌株大肠杆菌ATCC25922,购自中国兽医药品监察所.试验用大肠杆菌,2010年3—9月从黑龙江省5个受试养殖场分离鉴定出90株猪源大肠杆菌,随机选取其中60株用于氨基糖苷类药物耐药性,耐药表型和基因检测.1.2药品普通琼脂,水解酪蛋白琼脂培养基,杭州天和收稿日期:2011-06—27基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金(
5、DL09AA005)资助作者简介:薛原(1978一),女,黑龙江饶河人,讲师,博士,主要从事动物药理学与毒理学方面的研究.E—mail:xueyuan一1978@163.con微生物试剂有限公司生产;pMD18一T载体,TaqDNA聚合酶,dNTPBuffer,DL5000Marker等均为TaKaRa公司产品;庆大霉素,卡那霉素,新霉素,阿米卡星,均为杭州天和微生物试剂有限公司生产.1-3主要仪器PCR扩增仪为德国Biomerta公司产品;凝胶成像分析系统为美国AlphaImager2200公司产品.2试验方法2.1药敏试验采
6、用WHO(世界卫生组织)推荐的Kirby-Bauer法,每次测定均以质控菌株为对照,只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株结果才有效.按抗菌药物敏感性试验扩散法标准判定各菌株的敏感度,以敏感,中介,耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定.2.2目的基因扩增只要对阿米卡星,卡那霉素,新霉素,庆大霉素其中任意一种抗生素表现耐药,即检测其耐药基因.PCR扩增的模板为菌株质粒DNA.采用25LPCR扩增体系:模板2IxL,10xBuffer2.5p,L,dNTPs2L,上,下游引物各0.5L,TaqDNA聚合酶0.25L,灭菌双蒸水加
7、至25txL.引物[21由上海英骏生物技术有限公司合成.反应条件:95℃预变性15min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸1rain,共30个循环;72℃延伸10rain.PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析,aac(3)一I基因目的片段为169bp,aac(3)一1I基因目的片段为237bD,aac(6)一I基因目的片段为394bD.2011第5期薛原,等.猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物的耐药性以及耐药基因的检测1172.3目的基因序列测定将回收纯化的PCR产物与pMD18一T载体进行连接反应后,转化大肠杆菌
8、DH5a感受态细胞.碱裂解法提取质粒,经PCR初步鉴定,随机选取阳性质粒委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行核苷酸序列测定.利用DNAStar中MegAlign软件对测定的目的基因序列进行比对分析,确定出目的基因的优势序列.3结果3.1药敏试验60株大肠杆菌
