分子生物学实验技术方法

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1、【实验技术方法】分子生物学技术(zt)分子生物学技术 真核细胞DNA的制备与定量

2、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

3、λ噬菌体DNA提取

4、DNA分子的限制性内切酶消化

5、DNA片段回收与纯化

6、目的基因的亚克隆

7、PCR

8、引物参数计算

9、PCR产物的克隆

10、DNA序列测定

11、Southern杂交

12、PCR-SSCP

13、细胞凋亡

14、RNA操作中的一般要求

15、RNA的制备

16、mRNA的分离与纯化

17、RT-PCR

18、NorthernBlot

19、RPA

20、ddPCR

21、原位杂交

22、原核表达

23、蛋白SDS电泳

24、Western

25、表达蛋白的分离与纯化

26、表达蛋白的生物学活性的检测

27、真核转

28、染      真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采

29、取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1．TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。2．TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。3．裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4．20%SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75

30、%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。⑶加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。⑷60°C水浴1-3hr。2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。⑵离心4000g×5min，去除上清液。⑶加10倍体积的裂解缓冲液。⑷50-55°C水浴1-2hr。（二）DNA提取1.加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2.离心5000g×10min，取上层水相到

31、另一1.5ml离心管中。3.加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4.加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5.加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6.加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7.待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8.沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。9.室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50

32、-100mlTE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DN

33、A的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项1.所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4.用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern杂交、PCR等

34、）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。--------------------------------------------------------------------------------------------