EGFP原核表达分析

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1、EGFP的原核表达分析首都师范大学生命科学学院100048摘要：利用PCR反应扩增出所需要的EGFP基因，与pTrcHis蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌BL21,提取质粒，诱导EGFP蛋白表达，进行进一步的分离纯化并用SDS-PAGE和Western-blot做检测。这个实验让我们充分熟悉了整个流程。关键词：绿色荧光蛋白蛋白的诱导表达、分离纯化表达蛋白检测E.coli材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌BL21为本实验室保存；重组筛选质粒pTrcHis购自Invitroge公司。1.2、培养基：LB培养基（液/固）内含氨苄青霉素浓度为100ug/ml。1.3、器材和

2、试剂器材：移液枪、PCR仪、离心机—（HetticZENTRIFUGEND-78532Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4℃离心机)、SIGMA3-18K(离50ml大离心管)、紫外透射观察仪、水浴锅、核酸电泳仪（BIO-RAD）、超声波破碎仪（SONICSVIbracell）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、SDS-PAGE电泳装置、WesternBlotting电转移装置、水平摇床（WD-9405）、胶片观察灯（WD-9406）、封口机、超净台、250ml锥形瓶。试剂：PCR反应体系缓冲液（10~50mMTris-HCl，50mMKCl，1.5

3、mMMgCl2）、DNA聚合酶（TaqE）、dNTPs混合物（每种2.5mM）、博大泰克PCR产物快速回收试剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、EcoRI）、0.5MEDTA、琼脂糖凝胶（1g琼脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、电泳缓冲液（50xTAE、Tris—乙酸、EDTA）、溴酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购于Promega公司的T4DNA连接酶及10×ligationbuffer）、0.1MCaCl2、碱裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl，pH=8.0、10mMEDTA；溶液II：0.2MNaOH，1％SDS；溶液III：5MKAc，11.5ml冰醋酸

4、，加水定容至100ml）、RNaseA、无水乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含20mM咪唑）、冲洗液（含100mM咪唑）、洗脱液（含500mM咪唑）、5×样品缓冲液、30%凝胶贮液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液（4℃保存）、TEMED原液、10%过硫酸铵、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3）、考马斯亮蓝G250染色液、GFP抗体（200ug/ml，用pH=7.5TBS配置)、转移缓冲液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、显色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脱色液（（100ml冰乙酸:100ml乙醇:800ml蒸馏水）2、方法2．1、EGFP基因的PCR扩增及其

5、电泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为50ml)：10×buffer(Mg2+)5ml4×dNTPs（每种2.5mM）8mlEGFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate(模板)34mlTaqE1ml--------------------------------------------------------------------------------Totalvolume50µl循环参数94℃3min94℃30s55℃30s27cycle72℃1min72℃10min4℃保存2.2、PCR扩增产物的回收———试剂盒法1)、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放

6、入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。2)、上样：估计PCR反应液，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀,然后移入吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12000rpm离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。3)、漂洗：向吸附柱CB2中加入600ml漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），静止2min后，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。4)、漂洗：重复步骤3。5)、甩干：将吸附柱CB2放回收集管中，120

7、00rpm，离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2开盖置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。6)、洗脱：将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30~50ml洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。2.3、PCR扩增产物的电泳检测PCR产物6ml6x样品缓冲液1ml混匀后加入样品孔中，100V电泳20-30min2.4、酶切产物的回收———试剂