利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究

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1、山东农业大学博士学位论文利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究姓名：尹国华申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：温孚江20090505利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究3，扩增TMVCP基因，分别对扩增的PCR产物和L4440质粒进行几，I和Sail双酶切，构建LCP480载体；设计引物TMVCPI．5和TMVCPI．3、TMVCPII-5和耵州CPII．3、GUSII．5和GUSII．3，构建pGEM．CP480载体；设计引物CPI．5和CPI．3、CPII．5和CPII．3、GUSI．5

2、和GUSI．3，构建pET．CP480载体。(3)原核表达体系的构建：将构建成功的原核表达载体，转入构建的RNaseIII突变体和HTll5菌株中，获得原核表达体系。将构建好的原核表达体系，经IPTG诱导表达，均可提取长度约为660bp或者480bp的dsRNA，表明所构建的RNaseIII缺失体和HTl15菌株具有相同特性，均可以用于dsRNA的诱导表达。对不同的原核表达体系表达的dsRNA进行荧光定量PCR分析，结果表明：M．JMl09或者M．JMl09lacY菌株dsRNA的表达量明显高于其他菌株，载体pGEM．CP480为适宜生产dsRNA的表

3、达载体，因此M．JMl09／pGEM．CP480或者M．JMl091acY／pGEM．CP480为最优化的原核表达体系，其相对表达量分别为6．50+O．69和7．28±o．56。(4)抗病性检测：对来源于不同原核表达载体表达的dsRNA进行抗病性鉴定，结果表明，来源于不同原核表达载体表达的dsRNA抗病效果基本一致，都能达到50％左右的抗病率，说明不同的表达载体生产的dsRNA对TMV的防治并没有区别。抗病植株的Northernblot分析表明，抗病植株能够产生siRNA，而野生型对照植株则检测不到siRNA，外源的dsRNA能够防治植物病毒的侵染，这

4、种抗病性为RNA介导的抗病性。2、原核表达TMV不同功能基因dsRNA介导的抗病性比较研究(1)n州不同功能基因dsRNA表达载体的构建：Trizol法提取TMV总RNA，设计引物TMVRP．5和TMVRP．3，MMP．5和TMVMP．3，TMVRNA．5和TMVRNA．3，采用RT．PCR技术分别克隆了TMV复制酶基因、运动蛋白基因和54kDaRNA聚合酶基因的部分序列，采用PCR技术亚克隆三个基因480bp片段，反向重复插入pGEM．GUS载体，构建三个不同基因的dsRNA表达载体，分别为pGEM．RP480、pGEM．MP480和pGEM．RNA

5、480。将构建好的dsRNA表达载体转入HTl15菌株中，经IPTG诱导，均可表达480bp的dsRNA，证明所构建的dsRNA表达载体正确。(2)TMV不同功能基因dsRNA介导的抗病性比较：用原核表达的TMV复制酶基因、运动蛋白基因、54kDaRNA聚合酶基因和衣壳蛋白基因的dsRNA处理烟草植株，进行抗病性鉴定。初步的检测结果表明，原核表达删不同功能基因的dsRNA2山东农业大学博士学位论文均能保护植物抵抗TMV病毒的侵染，但介导的抗病性存在着差异。其中来源于运动蛋白基因的dsRNA介导的抗病效果最好，66％左右的处理植株表现为抗病；来源于衣壳蛋

6、白基因的dsRNA介导的抗病效果较好，48％的处理植株表现为抗病；而来源于54kDaRNA聚合酶基因和复制酶基因的dsRNA介导的抗病效果较差，表现为抗病的处理植株的比例分别为40％和34％。关键词：Red重组系统，RNA介导的抗病性，RNaseIll，dsRNA，TMV利用Red重组系统构建dsRNA原核表达体系抗烟草花叶病毒的研究ConstructionofadsRNAprokaryoticexpressionsystemusingRedrecombinationforresistancetoTobaccoMosaicVirusAbstractRe

7、combinantDNAtechnologyoffersaneffectivewaytoobtainvirusresistantplants．ThistechnologyisoftennamedasanRNA—mediatedvirusresistance．TheessenceofRNA-mediatedvirusresistanceisposttranscriptionalgenesilencing(PTGS)，alsoknownasRNAinterference(RNAi)．Compared埘tllotherbiotechnologicalappr

8、oachesinantiviraltransgenicengineering，RMVRishi