MicroRNA靶向PTENPI3K信号途径调控早期糖尿病肾病的研究

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1、重庆医科大学博士学位论文MicroRNA靶向PTEN/PI3K信号途径调控早期糖尿病肾病的研究姓名：张政申请学位级别：博士专业：生物医学工程指导教师：彭惠民20090501重庆医科大学博士研究生学位论文病肾病组中表达，214个miRNAs在对照组表达。糖尿病肾病组和对照组肾脏组织表达的miRNA有66个miRNAs差异有显著性(p

2、异显著(两组差异≥1．55倍)，在早期DN组和对照组的表达量信号值均较高提示可靠性、可重复性较好；差异显著表明与DN关系密切。这7个miRNAs分别为：miR．196a，miR-98和miR．29c在糖尿病肾病组高表达，miR．21，miR-451，miR-709和miR-187在糖尿病肾病组低表达。利用TaqMan⑩MicroRNAAssays定量RT．PCR试剂盒对部分miRNAs进行TaqMan探针荧光定量PCR，比较定量PCR结果与芯片结果，发现定量PCR结果与芯片结果趋势一致，表明芯片结果是可靠的，miRNAs参与了早期DN的发生。其中在细胞

3、的增殖、分化方面尤为活跃的miR-21受到关注。结论部分miRNAs在糖尿病肾病和正常对照肾脏组织中存在差异表达，可能参与了糖尿病肾病发生的分子机制。关键词：糖尿病肾病，microRNA，microRNA芯片，差异表达4重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分MiR．21的构建及靶基因的预测研究摘要目的microRNA(miRNA)芯片结合实时荧光定量RT-PCR检测发现的糖尿病肾病相关miRNA．miR．21的基础上，构建miR-21真核表达载体，预测miR-21的靶基因，为进一步了解miR-21的生物学功能及在糖尿病肾病中的作用奠定基础。方法人工合成

4、小鼠糖尿病肾病相关的miRNA．miR．21基因序列，并添加酶切位点及polyT转录终止序列，经退火处理后形成双链结构，插入真核表达载体pGenesil．1中，经酶切鉴定和测序证实后，构建成为miR-21真核表达载体(pGenesil．miR-21)。运用生物信息学技术预测miR-21的靶基因。结果合成的miR-21基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pGenesil．1上。通过生物信息学技术，应用互联网上miRNA靶基因预测软件(Pictar、Targetscan、MiRbase、MiRanda等)在线服务站点搜索miR-21预测的作用靶基因，发

5、现糖尿病肾病相关基因．张力蛋白在1O号染色体上同源缺失的磷酸酶(Phosphataseandatensinhomologdeletedfromchromosome10，PTZN)基因3'-UTR区有16个碱基位点与mmu．miR-21匹配，结合NCBI文献检索对靶序列进行综合分析发现，有实验室通过构建双荧光素酶报告基因检测系统发现miR-21可通过结5重庆医科大学博士研究生学位论文合与PTEN基因的3'UTR发挥其抑制靶基因表达的生物功能，因此PTEN基因可确立为miR-21的靶基因。结论miR-21真核表达载体的构建，为进行miR-21在体内外表达的

6、研究奠定基础，靶基因PTEN基因的初步确立，为进一步探讨miR-21在糖尿病肾病的信号途径分子机制提供依据。关键词：糖尿病肾病，microRNA，真核表达载体，基因6重庆医科大学博士研究生学位论文第三部分MiR．21调控肾小球系膜细胞增殖的PTEN／P13K信号途径研究摘要目的了解糖尿病肾病相关miRNA．miR．21在小鼠肾小球系膜细胞高低糖浓度培养下高表达对细胞生长、增殖的影响，及高表达miR-21的细胞PTEN／P13K信号途径关键分子的变化，为探索miR-21调控肾小球系膜细胞增殖的分子机制提供线索。方法采用高低糖浓度培养的小鼠肾小球系膜细胞模

7、拟糖尿病及正常状态，Lipofectamine2000转染miR-21真核表达载体(pGenesil．miR．21)，G418筛选，稳定表达。细胞共分为4组，分别为：高糖肾小球系膜细胞转染pGenesil．miR-21组、高糖肾小球系膜细胞转染对照空质粒组、高糖肾小球系膜细胞未转染组和低糖肾小球系膜细胞对照组。运用MTT法检测细胞增殖，real．timeRT-PCR检测转染质粒细胞miR-21的表达水平，westernblot、免疫细胞组化检测PTEN／P13K信号途径关键分子PTEN、p-Akt(Ser473)和P13Kp85a的蛋白质表达水平，生物

8、学软件分析图像结果。结果实时荧光定量RT-PCR检测miR-21表达的结果显示，在转染pGen