三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比较研究

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1、广西医科大学硕士学位论文三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比较研究姓名：姜艳华申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：樊晓晖20090501三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比较研究2006级硕上研究生学位论文背景和目的：三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比较研究摘要新城疫病毒(Newcastlediseasevires，NDV)属副黏病毒科(Paramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Paramyxovirus)成员，对禽类具有高度的致病性，在极少数情况下可以感染人类，表现为轻微的结膜炎或温和的呼吸道症状Ⅲ。研究发现，NDV在人类肿瘤细胞中的复制效率是在正常细

2、胞中的10000倍心1，这使得人们将它作为潜在的抗癌生物制剂口1。目前，NDV治疗肿瘤已经成为一种辅助及另类医疗方法(Complementaryandalternativemedicine，CAM)用于人类癌症的治疗，并已被广泛的研究H1。本研究通过M1]雌、HE染色法、电镜观察法、免疫组化法、流式细胞仪技术等实验方法，比较研究NDVD817株、NDV7793株$1NDVLaSota疫苗株体外对人喉癌Hep．2细胞及体内对人喉癌Hep．2细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制效应，同时将这3株NDV作用于人喉部正常组织细胞以对它们的安全性进行比较。材料和方法选取

3、分离自香港的NDVD817株和江西鄱阳的NDV7793株各1株及1株LaSota疫苗株，接种鸡胚以扩增病毒，48h后收取鸡胚尿囊液，测定血三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比较研究2006级硕士研究生学位论文凝效价／>1：1024后，调整病毒浓度至lxl08PFU／ml，．80。C冰箱保存备用。常规方法培养非洲绿猴肾细胞Vero．E6、人喉癌Hep．2细胞和人喉部正常组织细胞。将3株NDV病毒接种人喉癌Hep．2细胞进行选择性扩增，并用Vero．E6细胞进行蚀斑纯化。得到纯化病毒后再次扩增，检测其HA效价，并用MT-r法检测3株病毒对人喉癌Hep．2细胞

4、及人喉部正常组织细胞的杀伤作用。将处于对数生长期的Hep．2细胞用含O．25％胰酶和0．02％EDTA的消化液消化，收集并调整细胞密度为5x107个／ml的细胞悬液备用。每只裸鼠取1个注射点，用上述细胞悬液0．2ml／只注射于裸鼠皮下，接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，当肿瘤长径和短径均达5mm后进行随机分组。通过醛化红细胞法收集尿囊液中的病毒颗粒，PBS稀释至lxl07Pml作为NDV注射液，实验组每只裸鼠瘤内注射0．1ml。按规定时间测量肿瘤体积大小及裸鼠体重，绘制肿瘤生长曲线。NDV注射6周后处死裸鼠，秤量瘤块和脾脏重量，计算抑

5、瘤率和脾脏指数，进行毒性评价。肿瘤组织用10％的福尔马林溶液固定，进行HE染色，评价移植瘤细胞在光学显微镜下的病理变化；通过电镜观察移植瘤细胞的病理变化；通过流式细胞仪检测移植瘤细胞的凋亡情况；通过免疫组化S．P两步法检测移植瘤中Bax和Bcl．2蛋白的表达情况。结果：本研究选用的3株NDV在体外均能在人喉癌Hep．2细胞中复制增殖，均能杀伤Hep．2细胞，而且杀伤效应与病毒的作用剂量及作用时间成正比。在采用MTT法检测3株NDV对人喉癌Hep．2细胞及人喉部正常组织细胞的杀伤作用实验中，3株NDV杀伤肿瘤细胞作用均较强。当病毒稀释度为lxl0。时

6、，NDV作用细胞60h后NDVD817株、NDV7793株和NDVLaSota三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比较研究2006级硕士研究生学位论文株的杀伤率分别为96．65％、94．95％和95．35％．3株NDV对人喉部正常组织细胞影响相对较小(60h杀伤率≤25％)，差异具有统计学意义。72h后3株NDV的杀伤作用均出现不同程度的下降现象。在纯化后病毒的蚀斑实验中，从3株NDV蚀斑出现的时间及PFU数量来看，NDVD817株出现蚀斑的时间最早，蚀斑数量最多，NDV7793株出现蚀斑的时间最晚，蚀斑数量最少，NDVLaSota株居中。为了尽可能如实的

7、评价3株NDV对肿瘤的抑制增殖作用，本研究II期实验通过建立裸鼠移植瘤模型，从体内角度来研究3株NDV对人喉癌Hep．2细胞增殖的影响。裸鼠在接种Hep．2细胞后平均约4d后在接种部位可见瘤块生长，接种12d后肿瘤长径(L)和短径(、聊均可达5mm，移植瘤成瘤率为100％。在治疗过程中，治疗初各组肿瘤体积为：PBS阴性对照组平均肿瘤体积为(183．5±15．2)mm：‘，NDVD817组平均肿瘤体积为(175．4±19．4)mm3，NDV7793组平均肿瘤体积为(176．9±18．7)mm3，NDVLaSota组平均肿瘤体积为(185．4_+20．

8、4)mm3，顺铂阳性对照组平均肿瘤体积为(168．5_+21．5)mm3，各实验组间肿瘤体积无显著性差异。治疗期间肿瘤体积