登革病毒实验室检测技术(精美自制)

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1、登革病毒实验室诊断登革病毒的概述黄病毒科黄病毒属单股正链RNA登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个血清型形态结构球形，直径37nm～50nm含单股正链RNA，长度约11Kb编码3种结构蛋白，7种非结构蛋白5’-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’3’端非编码区含高度保守的核苷酸序列宿主范围3种自然宿主：伊蚊、人、低等灵长动物登革病毒成熟颗粒模拟图普通登革热：登革热(denguefever)是由登革热病毒所引起，由伊蚊传播的急性传染病。其临床特征为突起发热，头痛，全身肌肉、骨骼

2、和关节痛，极度疲乏，皮疹，淋巴结肿大及白细胞减少，部分病人有出血倾向，病情较轻，通常可自行恢复。登革出血热：病情较重，致死率高。通常发生于过去已感染过登革病毒而再次感染其他型别的人，发病的严重程度与病人血清原来存在的登革病毒抗体密切关系。登革休克综合症：全球形势DF广泛分布于有媒介伊蚊存在的热带、亚热带地域。在东南亚、西太平洋和加勒比海地区呈现地方性流行。世界卫生组织警告登革热病例正在迅猛增加已威胁到全球三分之一人口的健康安全WHO估计，全球约25亿的人群处于DF的威胁中。全球每年有5000万人感染登革热病毒，其中50

3、万为DHF病例（其中大部份为儿童）。目前全世界还没有有效的疫苗预防登革热。埃及伊蚊白纹伊蚊在东南亚及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介。在广东、广西，白纹伊蚊是主要媒介。白纹伊蚊孳生于房屋内外的浅水及积水中。成蚊白天吸血，嗜人血。传播媒介流行病学患者和隐性感染者是主要传染源。在流行期间，隐性感染者的数量可达全体人群的1/3，可能是最重要的传染源。主要发生于市镇人口集中地区，发病与布雷指数有关。雨季为发病高峰季节。广东省5~10月流行。其中8、9月份为高峰。有一定的周期性（4－5年）。人与人之间不会直接经过呼吸道、消化道或

4、接触等传播。人群易感性和免疫力人对登革病毒普遍易感，但感染后并非人人发病。由于对不同型别毒株感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病毒型产生的免疫对同型病毒免疫力可持续1～4年，而对异型病毒的免疫则短。登革热流行与预防有利于DF流行的因素登革病毒（带毒蚊、人、兽）输入输入地自然气候输入地伊蚊密度、屋内处积水容器、居民养花、养莲、建筑工地积水、水缸积水预防登革热健康提醒：1.到登革热流行区旅游或生活，应穿着长袖衣服及长裤，并在外露的皮肤及衣服上涂蚊虫驱避药物；2.如果房间没有空调设备，应装置蚊帐或防蚊网；3.使

5、用家用杀虫剂杀灭成蚊，并遵照包装指示使用适当的分量；4.避免在“花斑蚊”出没频繁时段在树荫、草丛、凉亭等户外阴暗处逗留；5.防止积水，清除伊蚊孳生地；6.尽量避免用清水养植植物；7.对于花瓶等容器，每星期至少清洗、换水一次，勿让花盆底盘留有积水。把所有用过的罐子及瓶子放进有盖的垃圾桶内。实验室确诊病例普通登革热：登革病毒血清特异性IgM抗体阳性，结合临床症状恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有4倍以上增长从急性病人血清、脑脊液或尸解脏器中分离到病毒或检测到病毒序列或检测到病毒抗原登革出血热：多器官大量出血肝肿大血容比增

6、加20％以上登革休克综合症：伴休克登革热实验室检测常规方法C6/36细胞培养技术登革病毒的分离和鉴定血凝抑制试验（HI）补体结合试验（CF）中和试验（NT）间接免疫荧光试验（IFA）酶联免疫吸附试验（ELISA）胶体金免疫层析快速诊断试验免疫斑点试验(DIBA)RT-PCR荧光PCR标本的采集与保存采集对象主要为登革热疑似病例、临床诊断病例等，必要时采集疑似病例的密切接触者标本。根据采样时间确定检测目的病原学检测初次感染：出现登革热症状的前1～2和发病后的3～5天再次感染：出现登革热症状的前后1～2天血清学检测初次感染

7、：出现登革热症状1周后可检测到IgM;2周后可检测到IgG再次感染：出现登革热症状后1～2天可检测到IgM和IgG标本的采集与保存蚊媒标本主要为埃及伊蚊、白纹伊蚊或其它可疑蚊种，检测抗原，常用于登革病毒监测。采集回来的蚊子置－20℃冻死后，按蚊种及捕获地点分组，以每组20～50只分装于螺口冻存管，－70ºC冰箱或液氮保存。蚊媒标本的检测目的是登革病毒分离或登革病毒核酸检测，因此标本采集后应确保存于超低温条件下。蚊虫标本研磨程序一组标本（50只蚊子）转入1.5ml的eppendorf离心管加入100µl标本处理液用小型电

8、动研磨器将蚊子磨匀补加900µl标本处理液4ºC，10000rpm，离心10min标本处理液:MEM90ml小牛血清2ml庆大霉素（50µg/ml)100µl两性霉素B（1000µg/ml）1ml青链霉素（1000U/ml）1ml用7.5%碳酸氢钠溶液调至PH7.2。用于：登革病毒分离登革病毒核酸检测剩余的研磨液需保存在-70ºC