应用荧光技术检测细胞中二硫键_百替生物

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1、应用荧光技术检测细胞中二硫键张璇摘要：金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异性蛋白质。本文主要介绍从动物体内真核表达经过凝胶过滤、离子交换、亲和层析等方法纯化获得金属硫蛋白，并制得脱金属硫蛋白用来制备重组Zn-MT。关键词：金属硫蛋白(MT)，纯化，超滤，Zn-MT1实验方案及原理1.1实验方案蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分，要得到各种蛋白质，往往从动植物体内直接提取开始。本试验采取文献[1]记载的方法，用重金属镉诱导兔肝产生Cd-MT，

2、有机溶剂沉淀法提取蛋白质后，过分子筛分离出金属硫蛋白，又利用离子交换的方法将MT1与MT2分开，获得两种不同的金属硫蛋白。锌离子对于地球上的生物来说是一种很重要的营养物质。这种金属元素在许多生物活动中都起着很关键的作用。在肝合成的Zn-MT被认为是体内锌的储备和转运形式，即“锌池”，可被其他组织利用。为了获得Zn-MT，本试验采用文献[2]记载的方法，用DTT进行巯基保护后在强酸的条件下使金属硫蛋白上的金属脱离，过分子筛把它们分离，获得脱金属硫蛋白。再加入过量的Zn以获得Zn重组金属硫蛋白。1.2技术路线1.2.1真核表达

3、金属硫蛋白的提取与纯化新西兰兔↓图1-1Cd诱导产生Cd-MT兔肝中↓金属硫有机溶剂沉淀法得兔肝粗提液蛋白的↓纯化步分子筛分离金属硫蛋白骤↓离子交换层析分离MT1,2www.100biotech.com↓service@100biotech.com离子交换层析浓缩↓MT1,21.2.2脱金属硫蛋白以及Zn重组金属硫蛋白的制备Cd-MT↓DTT巯基保护↓强酸条件脱掉金属↓分子筛提纯↓apo-MT↓加过量的Zn2+↓超滤脱盐↓Zn-MT图1-2脱金属硫蛋白制取Zn重组硫蛋白步骤1.3实验原理1.3.1有机溶剂沉淀法提取蛋白质细

4、胞外液体活细胞抽提物中的水溶性蛋白质可与水混融的有机溶剂沉淀。常用的两种有机溶剂是乙醇和丙酮。向蛋白质水溶液加入这些有机溶剂则可降低水对带电的亲水蛋白质分子的溶解力，使蛋白质聚合和沉淀。影响沉淀的要点是蛋白质分子的大小。其他条件相同时，蛋白质分子越大，沉淀蛋白质所需有机溶剂量越少。在蛋白质的等电点附近，较低浓度的有机溶剂也能使蛋白质沉淀。这个事实支持了下述家说：有机溶剂使蛋白质沉淀（聚合）可能是由于蛋白质结构中的静电力和偶极范德华力暴露出来，并相互作用的结果。用有机溶剂沉淀蛋白质时，温度要保持在0oC左右，防止有机溶剂与水

5、混合时产生的热使蛋白质变性。含蛋白质的抽提液和有机溶剂都要预冷，然后才能加入有机溶剂。加入的速度要相当慢，搅拌要充分，防止局部有机溶剂浓度过高。加入有机溶剂后，可通过离心，小心倾出上清而除去沉淀。对沉淀交替抽空、放空几次，以除去沉淀中残余的有机溶剂，直至检测不出有机溶剂为止。然后将沉淀溶解在最少量的适当缓冲液中[3]。1.3.2表达产物的获取细胞破碎指用一定的方法在一定程度上破坏细胞壁和膜，设法使胞内产物最大程度释放到液相中去。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。细

6、胞的破碎根据作用方式不同，基本可分为两大类：机械法和非机械法。实验室一般采用的超声破碎法属于机械法，即输入高能超声波破碎细胞，www.100biotech.comservice@100biotech.com由于超声波的空穴作用引起的冲击力和剪切力可以使细胞破碎。空穴作用是在超声波作用下经历气泡形成，长大和破碎，在气泡破碎期间，大量声能被转化为机械能，引起局部的剪切使细胞破碎。1.3.3表达产物的纯化1.凝胶过滤层析（GelFiltrationChromatography,GFC）凝胶过滤层析是利用具有多孔网状结构的凝胶颗粒

7、的分子筛作用，根据被分离样品中各组分分子量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。该技术在分离纯化蛋白质时具有操作方便、洗脱条件温和、重复性好、不需要有机溶剂、样品不易变性和回收率高等优点。该技术主要可用于蛋白质的纯化，分子量及其分布范围测定，样品脱盐以及更换蛋白质缓冲液等。采用凝胶过滤层析可将不同分子大小的样品分离开来，这主要归因于固定相基质——凝胶。凝胶是一种具有三维多空网状结构的珠状颗粒物，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不

8、同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当流动相中的蛋白质混合样品在凝胶颗粒间流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质则进入网格内部，小分子蛋白质的下移速度落后于大分子的蛋白质，从而使样品中分子大的蛋白质先流出层析柱，中等分子的蛋白质分子滞后