脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展

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1、脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展【关键词】脐带血;间充质干细胞;分化骨髓是间充质干细胞的丰富来源，但是关于脐血及循环血中是否存在MSC，在研究初期一直存在争议。2000年，Erices[1]等首次报导了从脐带血中分离培养出低密度类似骨髓MSCs的贴壁细胞，其表达SH1，SH2等间充质细胞标志抗原，并可分化成为成骨细胞和脂肪细胞，其免疫表形和功能特点与骨髓来源的MSC极为相似，同时发现早产儿脐血中间充质干细胞的含量要较足月儿丰富。有研究者证明，脐带血中含有间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)，并且具有多向分化潜能[2]和很高的

2、可塑性。　　人脐血MSCs有干细胞的共性，即具有自我更新并多向分化的潜能。在不同诱导条件下，人脐血MSCs除具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞分化的能力外[3]还可跨胚层分化为外胚层的神经细胞和内胚层的肝细胞等[4]。由于MSCs的多向分化潜能、胚胎干细胞的特性、对造血作用的影响及典型的免疫调控作用，在体外易分离扩增，具有自我更新和多向分化的潜能，来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，使其成为研究的新的热点之一。　　1MSCs的分离和培养13　　脐血采集：选择健康足月产或早产妇，胎儿娩出后，在距胎儿57cm的脐带处进行结扎，剪断脐带，穿刺脐静脉，用

3、含抗凝保护液的采血袋抽取50ml左右的脐血，4℃冰箱保存，4小时内处理标本。　　MSCs存在于人的多种组织，但普遍存在于成人的骨髓。1976年，Friedenstein等人根据骨髓来源的成纤维样细胞和造血干细胞系对培养皿底部的粘附性的差异，首次从兔骨髓中成功分离了MSCs[5]。此方法到目前为止被认为是一种有效的分离骨髓的方法，但是用这种方法分离的MSCs中含脂肪细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和部分的血细胞与造血干细胞[6]。13　　近年来，对MSCs的分离的方法主要有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞分离法和免疫磁珠法等。目前常用的方法是先用Fico

4、ll或Percoll分离液进行密度梯度离心分离出脐血单个核细胞，再依据MSCs在体外培养中贴壁生长的特性，用贴壁筛选法，将其与非贴壁细胞分离。此法虽然分离所得细胞纯度不高，但简单易行，对细胞的损伤小，能较好地保持细胞活性。流式细胞分离法是根据MSCs体积大小及细胞表面的一些特殊标志，采用流式细胞仪对其进行分选。免疫磁珠法是使用表面附有特异性抗体的磁珠与MSCs结合，再用永久磁铁吸引出MSCs。后两种方法可分离出纯度较高的MSCs,但分离过程对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失活，而且对实验条件要求较高，费用昂贵，所需样本量大，所以并未得到广泛应用[7]。　　也有

5、学者采用单细胞克隆技术获取纯的干细胞株[8]。有些研究还发现脐血中的间充质干细胞的频率随妊娠时间的延长而逐渐下降，推测这种现象与发育过程中造血部位向骨髓的迁移有关。Karen等[9]发现，MSCs分离较为合适条件是，样本保存时间不超过15个小时，样本中血液体积要超过33mL，并且血液中要没有血凝块和胰酶，单份血液中的单个核细胞的数量要大于1×108。　　随着研究脐带血间充质干细胞的学者越来越多，结论也越来越趋于一致，脐血中的确存在着MSC，但脐血间充质细胞所占的比例远较骨髓低的多(0.052.8/1×106脐血单个核细胞，25/1×106骨髓单个核细胞),MS

6、C连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，而且保持正常的核型和端粒酶活性。细胞周期研究表明，85%以上的MSC处于Gl/GO期，用流式细胞仪分析MSC的RNA和DNA含量发现，脐带血MSC有5%处于GO期，而骨髓MSC有20%处于GO期。　　在培养方面还没有统一的方法，培养的方案也各不相同。目前常用的培养基有MesencultTM、DMEM、IMEM及DMEM/F12培养基等。Romanov等[10]用含10%胎牛血清LGDMEM培养基培养出优质生长良好的间充质干细胞。Lee[11]用含20%胎牛血清，L13谷氨酰胺的IMDM培养基，并加入碱性成纤维生长因

7、子，也培养出生长良好的干细胞。但是由于胎牛血清在一些情况下促分化作用强于促增殖作用，因此近年来在以干细胞增殖为目的的培养中越来越多的采用低血清或无血清培养体系，以提高MSCs的增殖能力和分化潜能。研究还发现不同的接种密度、不同的pH值、不同的首次换液时间都会影响mscs的生长。　　2脐血间充质干细胞的形态和表面标记　　体外培养的脐血MCS形态与骨髓MSC相似，呈梭形或纺锤形，原代培养的脐血，在接种4～7d后出现贴壁的间充质样细胞，开始为圆形或不规则形，逐渐伸出突起，最初散在分布，与大量的破骨样细胞混杂存在。破骨样细胞胞体较大、多核，MSCs多为成纤维样的长梭形细胞

8、，少部分呈