人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性

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1、人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性【关键词】内皮抑素腺病毒基因治疗抗血管治疗乳腺癌　　0引言　　近年来，阻止肿瘤血管生成，控制肿瘤的生长和转移，成为肿瘤治疗的一项新策略［1，2］，其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成，以内皮抑素最为理想［3］。本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体，研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。　　1材料与方法　　1.1材料　　携带人内皮抑素基因（humanendostatin,hE）的质粒pBlasthEndostat

2、in购于美国InvitroGen公司；腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于MicrobixBiosystems公司；人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC细胞库；LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司；各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司；QIAprepspinminiprepkit、QIAamp7DNABloodMiniKit购自QIAGEN公司；MPERMammalianProteinExtractionReag

3、ent购自PIERCE公司；Western显色液LumiGLOchemiluminescentreagentandperoxide为CellSignalingTechnology公司产品；鼠抗人hE单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德公司；携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒AdLacZ由东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室保存。　　1.2腺病毒载体质粒pAdhE的构建　　根据GenBankAF184060基因序列（555bp），在hE基因上下游分别设计引物，上游引物

4、P1:5’CGGAATTCACCATGCACAGCCACCGC3’,下游引物P2:5’GCTCTAGATTACTACTTGGAGGCAGT3’。引物上下游分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。引物由上海基康生物技术公司合成。以pBlasthEndostatin为模板，P1、P2为引物，对hE基因进行PCR扩增，获得573bp大小的hE基因片段。插入pUC19质粒中，送上海基康生物公司测序。测序正确后，EcoRI＋XbaI酶切片段插入腺病毒载体pCA13的相应酶切位点，并通过PCR方法在hE基因上游引入M成瘤蛋白

5、的信号肽，构建成功pAdhE。　　1.3携带hE基因的腺病毒AdhE的重组与鉴定7　　培养293细胞至对数生长期，采用Lipofectamine2000，将质粒pAdhE与pBGHE3(缺失188～1339bp的5型腺病毒)共转染至293细胞内进行同源重组。转染后10～14d出现病毒空斑，经病毒空斑纯化，应用QIAampDNABloodMiniKit提取腺病毒DNA，应用引物P1和P2进行PCR鉴定。鉴定正确者命名为AdhE。采用293细胞进行病毒的扩增，以氯化铯梯度离心进行病毒纯化，测定病毒滴度。　　1.4免疫荧

6、光和免疫印迹检测hE在乳腺癌细胞中的表达　　在6孔板上接种人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7，1×104个细胞／孔，以重复感染度（MOI）为10的感染强度，感染重组病毒AdhE。继续培养48h后，收集细胞。取少量细胞悬液滴在玻片上，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察hE的表达。其余细胞以MPERMammalianProteinExtractionReagent裂解后回收蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中70V恒压电泳，分离蛋白质，3V，90mA条件下用电转移仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，进行WesternBlot检

7、测。　　1.5重组腺病毒表达hE的活性鉴定　　以ECV304为靶细胞，接种至6孔板中培养，1×105个细胞/孔，培养24h。以MOI＝100、10、1、0.1、0.01、0分别感染重组腺病毒AdhE或AdLacZ后继续培养，在病毒感染后第3d,7用10%结晶紫福尔马林溶液固定10min，龙胆紫染色。　　2结果　　2.1腺病毒载体质粒pAdhE及重组腺病毒AdhE的鉴定见图1A～1B　　图1腺病毒载体质粒pAdhE及重组腺病毒AdhE的鉴定（略）　　A:质粒EcoRI＋XbaI双酶切，1pCA13；2pAdhE

8、；3LambdaDNA／EcoRI＋HindIII。B：重组病毒PCR扩增，1100bpDNALadder；2AdhE；3阴性对照；4pBlasthEndostatin阳性对照。　　2.2基因表达的鉴定　　乳腺癌细胞株MBD231和MCF7以MOI＝10感染重组病毒AdhE后，进行免疫荧光标记