人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达

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1、人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达作者：姜立马文丽柯杰兵彭翼飞李晋徐兵郑文岭【摘要】目的构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶（OAZ）突变基因，重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位碱基T碱基缺失，使核糖体的阅读框+1移位，连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后，重组质粒转化BL21菌，进行突变基因的蛋白表达。结果重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失，其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ

2、全长蛋白，SDS-PAGE分析在相对分子质量45900左右出现新的蛋白条带。结论成功构建人OAZ突变基因重组质粒，转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。【关键词】鸟氨酸脱羧酶抗；突变；蛋白表达鸟氨酸脱羧酶（ornithinedecarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的关键酶，催化多聚胺生物合成途径中的第一步——鸟氨酸向腐胺的转变。随后，腐胺再转变为亚精胺、精胺。ODC是该代谢途径的限速酶，在此过程中扮演着重要的调控酶角色，其活性可在转录、翻译和翻译后水平受到精确的

3、调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶（ornithinedecarboxylase8antizyme,OAZ）是在翻译后水平的一种调控形式，它可以连接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，从而负性调控细胞内多聚胺含量。有研究表明，细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。由此推测，OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象，其表达受到精胺的一个称之为frame-shifting的核糖体移位的调控。多聚胺通过这种较

4、罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度，使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。OAZ转录本的编码存在两个不同的阅读框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其实是一个由短的非保守的ORF1产物和高度保守的ORF2产物的组合。在OAZmRNA的阅读框中，需要有一个+1的翻译移码过程。在ORF1的5′8端终止密码子处，通常序列为TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻译框架达到TGA时，如果没有精胺的存在，核糖体将接受TGA为终止密码子，翻译到此终止。当精胺浓度一定时，核糖体的翻

5、译即可受到精胺的调控进行+1移码，跃过终止密码子TGA上的T，以GAT指导的天冬氨酸为后续，翻译合成ORF2［4-5］。翻译框架移码受到细胞内多聚胺水平上升的正调控，表达出的OAZ蛋白又能调节ODC的酶活性，反向调节细胞内多聚胺的水平，从而影响到细胞的生长及分化。在生长旺盛的肿瘤组织中，普遍发现了ODC的高表达，因此，OAZ蛋白特有的调控ODC活性的功能，就使之成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表达受到精胺的诱导，缺乏精胺时，核糖体将不能进行+1的移位，翻译完整的全长OAZ蛋白。为此，本研究对OA

6、Z基因进行了特定T碱基的缺失突变，成功构建至表达载体pET-32a中，测序确认后命名为pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表达出OAZ全长蛋白，将对进一步研究该基因的功能以及以OAZ为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备，具有重要意义。1材料和方法1.1试剂大肠杆菌DH5α、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild质粒由本实验室保存。QuikChange定点突变试剂盒购自Stratagene公司。质粒纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、Xho

7、Ⅰ和EcoRⅠ内切酶均购自TaKaRa公司，其余生化试剂均为国产分析纯。引物根据OAZ基因所需点缺失碱基处进行设计2条反向互补引物对P1与P2。P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。1.2方法1.2.1反向PCR扩增以pET-32a-OAZ-wild质粒为模板进行PCR反应:将pET-32a-OAZ-wild质粒(10mg/L)1μl、dNTP1μl、10×Buffer5μl、P1与P2引物(1

8、00mg/L)各2.5μl、PfuTurboDNA多聚酶(2.5×106U/L)1μl、双蒸馏水37μl加入PCR管;95℃预变性30s后，95℃30s、55℃1min、68℃6min，共18个循环。PCR产物置于冰上2min,加入1.5μlDpnⅠ内切酶(106U/L),37℃水浴2h，酶解模板DNA。1.2.2转化大肠杆菌DH5α取感受态大肠杆菌50μl,加入上述DpnⅠ处理液10