小鼠白细胞介素12基因在乳酸乳球菌中的表达

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1、小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达作者：周强，周巧梅，李云，庞庆丰，曾因明【摘要】目的在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因。方法用NsiⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A（nisA）启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒；经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中，转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用乳链杆菌肽（nisin）诱导白细胞介素-12表达，SDS－PAGE、Westernblot鉴定表达产物；用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-12的量。结果建立了白细胞介素-12

2、乳酸菌基因表达系统。在nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80ng/Ｌ。结论乳酸乳球菌能够表达一定数量的小鼠白细胞介素-12。【关键词】白细胞介素-12；基因克隆；乳酸乳球白细胞介素-12（interleukin12，IL-12）主要由B细胞、T细胞、单核巨噬细胞产生的一种具有多种功能的细胞因子。它能够促进NK细胞、T细胞的增殖和杀伤活性，诱导γ-干扰素等细胞因子的产生，调节Th1细胞的发育，具有良好的临床应用前景。目前已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗哮喘的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验阶段［1~5］。人重组IL-12（recombinanthumaninterl

3、eukin-12，rhIL-12）的临床试验提示rh8IL-12在治疗肿瘤、病毒感染性疾病及哮喘中具有肯定的效果。国内、外均采用基因工程的技术使用逆转录病毒和重组腺病毒载体介导的方法在COS-7细胞、肝癌细胞株中进行体外表达得到rhIL-12［6-7］。但存在着成本昂贵、操作技术复杂、表达量较低、需多次提取纯化才能使用等缺点。而如果将携带rhIL-12的逆转录病毒或重组腺病毒载体静脉注射或局部注射使rhIL-12在体内表达，则存在的主要问题是:转移效率低，免疫原性强，外源基因在细胞中只能短期表达［8-9］。因此寻找一种简便而又实用的开发rhIL-12的方法使其尽快成为一个新的药物非

4、常重要。近年来，人们在研究乳酸菌的过程中所建立的乳酸菌基因表达系统为有效地开发和利用rhIL-12提供了新的机遇。本研究报道了小鼠IL-12基因在食品级微生物乳酸乳球菌中的活性表达，从而为以乳酸乳球菌为基础的IL-12应用研究提供依据。1材料和方法1.1质粒、菌株及培养条件乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）NZ9000和pSEC-E7质粒为法国农业科学院Luis教授赠送，大肠杆菌DH5α、pGEM-IL-12载体为本实验室保存；其中大肠杆菌DH5α用于质粒pSEC-E及其衍生质粒保存或扩增的标准菌株，乳酸乳球菌NZ9000用作IL-12基因重组表达质粒pSEC-IL-

5、12的表达菌株。大肠杆菌用LB培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。氨苄青霉素使用浓度为100mg/L，氯霉素使用浓度大肠杆菌为10mg/L、乳酸乳球菌为5mg/L。IL-12酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海森雄公司。81.2重组质粒的构建及转化重组质粒构建如下：用NsiⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有nisA启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒，pSEC-IL-12质粒含有Usp45信号肽。乳酸乳球菌转化采用电穿孔转化法，电穿孔仪为美国Bio-Rad公司，脉冲参数为1.25kV/mm，2

6、5μF和200Ω。重组质粒经电击转化乳酸乳球菌NZ9000，转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再从重组乳酸乳球菌中提取质粒pSEC-IL-12，进行电泳鉴定。1.3小鼠HO-1基因在乳酸乳球菌中的诱导表达含重组质粒pSEC-IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在脑心浸液培养基中30℃静置培养过夜,用新鲜培养基1∶50稀释，培养至OD600＝0.5～0.6时，加入诱导物Nisin至终浓度10mg/L，继续培养3h。终止培养后，取2ml培养菌液，4℃、8000r/min离心5min，上清液浓缩50倍后经15％SDS-PAGE电泳分离后，通过Bio-Rad印迹仪转移至硝酸纤维素

7、膜上作Western-blot。以空载体Lactococcuslactis为对照。取1ml培养菌液用ELISA试剂盒测定IL-12的产量。2结果2.1IL-12在细菌中的转化，提抽，鉴定将pSEC-IL-12转化至DH5α中，提抽质粒并做DNA测序，测序结果见图1，碱基数目及顺序与预期设计结果相符合，在LB培养基平板上大量扩增细菌并提取获得质粒，将其再转化到NZ9000。从NZ9000中提取质粒做电泳鉴定（图2）。由图2可见，在DH5α8和NZ9000中提抽到的质粒D