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时间:2019-05-12
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1、氨氯地平对兔主动脉PDGFA表达的影响【关键词】氨氯地平PDGFA动脉硬化 1对象和方法 实验分为3组(每组3只),正常对照组:普通饲料喂养大白兔;动脉硬化组:高脂肪、高胆固醇饲料喂养的动脉硬化模型兔(吉林省科技开发中心提供);氨氯地平组:动脉硬化模型兔服用氨氯地平(美国辉瑞Pfizer公司),3mg/(kg·d),连续6wk后,活体分离兔主动脉壁,液氮速冻后研碎.向1g组织碎末中加入5mL异硫氰酸胍变性溶液,混匀,用16号针头低温下反复抽吸裂解液,直至溶液不再粘稠,加0.5mL的2mol/L乙酸钠(pH4.0),5mL饱和酚和
2、1ml氯仿异戊醇混合液(49∶1),混匀,冰浴15min,沉降、离心、干燥后,采用紫外分光光度法测量所提取的组织中RNA的A260nm值和A280nm值,通过甲醛琼脂糖凝胶电泳分离RNA.用含有DNA探针(100ng/mL)的杂交液,经过转膜、预杂交、杂交、滤膜及显色反应,对主动脉壁平滑肌细胞的RNA进行斑点和Nouthern杂交.对各组检测结果进行分析. 2结果 由碱裂解法提取DNA的电泳结果可以看出,质粒的大小与预期的结果一致.探针DNA的电泳结果显示PDGF的基因片段大小约600bp,而标记后的DNA中由于用修饰后的脲嘧
3、啶取代了部分胸腺嘧啶,所以探针DNA的分子质量比原基因片段的分子质量要大,电泳结果也与预期一致.紫外分光光度法测定探针DNA浓度显示A260nm=1时,双链DNA的浓度为50μg/mL.探针DNA浓度:2.0μ3g/mL.紫外分光光度法测定总RNA显示当A260nm=1时,单链RNA的浓度为40μg/mL.动脉硬化组:A260nm/A280nm=1.95,RNA浓度为5.3μg/μl.氨氯地平组:A260nm/A280nm=2.01,RNA浓度为5.5μg/μL.对照组:A260nm/A280nm=1.95,RNA浓度为4.3μg/μ
4、L.斑点杂交结果显示动脉硬化兔主动脉壁平滑肌细胞总RNA中PDGF的表达水平很高;氨氯地平组PDGF基因的表达水平较动脉硬化组明显降低约200倍;正常对照组PDGF的mRNA表达水平很低,斑点杂交时几乎检测不到PDGF基因的表达.Nouthern杂交可见与斑点杂交相似的结果,而且各组动脉平滑肌细胞总RNA经电泳分离后只有一条特异的杂交带出现,说明DNA探针的特异性较高. 3讨论 血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)是动脉壁平滑肌细胞中主要的细胞有丝分裂原,能促平滑肌细胞分裂、增殖
5、,与动脉粥样硬化密切相关.PDGF的表达受到严格控制,在正常动脉存在着PDGF的基因转录,但正常细胞表达水平很低甚至检测不出.而在动脉硬化的血管平滑肌细胞中却能大量表达PDGFA,故认为平滑肌细胞移行、增生是动脉硬化形成发展的重要因素,而能刺激平滑肌细胞移行、增生的生长因子PDGF则更为关键[1].由于本研究用RT3PCR法从动脉硬化模型兔的主动脉壁平滑肌细胞分离得到了PDGF基因的高表达,说明在动脉硬化的平滑肌细胞中含有大量的PDGF,进一步证实了PDGF的表达与动脉硬化的关系及其意义.本研究通过观察动脉硬化时平滑肌细胞PDGF
6、的表达水平以及钙通道阻滞剂氨氯地平对PDGF表达的影响,发现动脉硬化组PDGF表达明显增强;氨氯地平组PDGF表达明显低于动脉硬化组,证实了氨氯地平能有效降低动脉硬化的平滑肌细胞PDGF的合成,进而抑制平滑肌细胞增生、移行,防止抗动脉硬化的病变.也为氨氯地平抗高血压、预防动脉硬化的作用提供了分子水平上的依据.【参考文献】 [1]NadarSK,BlannAD,LipGY,etal.Plasmaandplateletderivedvascularendothelialgrowthfactorandangiopoietin1 inh
7、ypertension:effectsofantihypertensivetherapy[J].InternMed.2004,256(4):331-337.3
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