腺病毒载体介导HBV抗原基因修饰树突状细胞诱导特异性CTL反应的实验研究

《腺病毒载体介导HBV抗原基因修饰树突状细胞诱导特异性CTL反应的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学博士学位论文腺病毒载体介导HBV抗原基因修饰树突状细胞诱导特异性CTL反应的实验研究姓名：黄呈辉申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：姚集鲁2003.4.28中山大学博士学位论文中文摘要腺病毒载体介导HBV抗原基因修饰树突状细胞诱导特异性CTL反应的实验研究专业：内科学博士生：黄呈辉指导教师：姚集鲁教授摘要、／＼＼心我国是乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染的高流行区，乙型肝炎病毒携带者约1亿2千万，其中慢性肝炎患者3千万。目前对慢性乙型肝炎患者尚缺乏有效的治疗方法．导致部分病人病情迁延不愈，最终可发展为肝硬化和肝癌，给社会和家庭带来沉重的

2、经济负担，危害极大。虽然抗病毒药物如干扰素、核苷类似物治疗显示一定的效果，也取得一定的疗效，但停药后容易反跳，并不能完全清除病毒，难于取得持久的疗效。基因治疗作为近年来发展的一种新的抗病毒途径，在控制HBV感染方面已经显示其良好的应用前景，但病毒性肝炎的基因治疗尚处于实验性基础研究阶段，临床应用尚面临诸多问题需要进一步解决。因此，研究新的有效治疗FIBV感染的措施非常重要。树突状细胞(Dendriticceils，DC)是目前发现功能最强的抗原提呈细胞(Antigen-presentingcell，APC)，能在体内外直接激活初始型T(naiveT)淋巴细胞，提呈抗原给M

3、HCI类限制性CD8+和MHCII类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫应答反应。HBV感染容易转为慢性，慢性肝炎患者常表现为免疫应答低下或缺失，造成机体对病毒表现一种免疫耐受状态，体内产生微弱的CTL反应，不足以清除病毒。现有研究表明，造成慢性肝炎患者免疫耐受的原因之一是患者体内DC抗原提呈功能存在缺中山大学博士学位论文中文摘要陷，不能将抗原的信号传递给机体的免疫系统而发挥免疫清除效应。国内外研究显示，慢性病毒性肝炎的发生与DC功能缺陷有关，通过上调DC介导的特异性免疫反应(CTL)来清除体内的HBV是可能的。有研究报道，在体外培养的条件下，经过HBV多肽抗原或蛋白

4、质等抗原激活DC，制备特异的DC疫苗在体内外能诱导特异的抗体和CTL效应。如何使成熟的DC负载病毒抗原，是目前研究的重点，也是能否诱导特异性CTL产生的关键。现多通过体外用病毒抗原冲击致敏DC，再回输体内，诱导出病毒特异性CTL，杀伤病毒感染的细胞。但大多数MHC限制性抗原多肽的半衰期短，需要用抗原多肤反复多次体外致敏DC。在DC疫苗抗肿瘤治疗研究中发现，通过将肿瘤相关基因导入DC，可以产生持续抗肿瘤效应。将HBV抗原基因导入效应，是一个值得探讨疫苗，能否产生持续抗HBV感染免疫本课题研究目的：(1)构建表达HBV抗原基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，了解腺病毒介导HBV抗

5、原基因在哺乳动物细胞中的表达；(2)建立脐带血体外分离诱导DC的方法；(3)采用复制缺陷型重组腺病毒介导HBV抗原基因修饰脐带血来源的DC，建立抗HBV的DC疫苗，观察HBV抗原基因修饰的DC体外诱导产生特异性CTL效应，为慢性乙型肝炎的治疗探索一种新的免疫治疗措施。1．HBV抗原基因复制缺陷型重组腺病毒的制备和体外表达。nC首先，我们用AdEasy系统制各携带HBV抗原基因复制缺陷型重组腺≮瓶设计带酶切位点的3对特异性引物，用PCR方法分别扩增HBV前sgs基因(pre—SJS)、前C／C基因(pre·C／C)和C基因片段，克隆到pBluscriptKS+-T载体上，并

6、进行序列分析。双酶切阳性pBluscriptKS+．T载体质粒，回收酶切目的片段分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack．CMV上，经PineI酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染E．coli．BJSl83细菌，经卡那霉素抗性平板培养筛选，挑选细小菌落提取质粒，用0．7％琼脂糖凝胶电泳鉴定和PacI酶切鉴定，获得重组腺病毒质粒。最后取PacI酶切线性化的重组腺病毒质粒，用脂质体法转染腺病毒包装细胞系293细胞，经7～10d培养产生第一代重组腺病毒。取第一代重组腺病毒在293中山大学博士学位论文中文摘要细胞中增殖2次，获得第三代腺病毒，采用观察增强型绿色

7、荧光蛋白(EGFP)表达法进行病毒滴度测定。取制各3种重组腺病毒，以一定的感染复数(multiplicityofinfection，MOI)分别感染人胚肾细胞(293)、绿猴肾细胞(Vero)、肝母细胞瘤细胞(HepG2)和脐带血来源的间质干细胞(MSC)，分别通过倒置荧光显微镜检测与HBV抗原基因共表达EGFP的产生、RT-PCR检测转染细胞中HBV抗原基因的mRNA的转录表达和ELISA法检测目的蛋白HBsAg和HBeAg来了解腺病毒介导HBV抗原基因在哺乳动物细胞中的表达，并用SDS-PAGE蛋白电泳分析HBV抗原基因的