混合型人工肝支持系统的构建及其临床应用研究

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1、2003浙江大学博士学位论文中文摘要2003浙江大学博上学位论文重型肝炎的治疗是临床上一大难题，常规内科治疗疗效欠佳，肝移植是肝衰竭的一种有效的治疗手段，但面临着患者病情危重及供体来源困难等情况。人工肝的研究为重型肝炎的治疗提供了一条崭新的途径。近年来随着肝细胞分离，高密度培养以及生物反应器等技术的同趋成熟，新一代以培养肝细胞为基础的结合了非生物人工肝与生物人工肝优点的混合型人工肝装置已成为研究热点。该方法在理论上解决了肝衰竭患者体内积累的大量代谢产物及毒性物质难以在有限的交换中由培养肝细胞解毒的问题，可使人工肝的生物合成转化功能及解毒作用更加完善。本研究旨在建

2、立猪肝细胞高质量分离和培养的方法，并对培养肝细胞的功能和形态进行研究；使用重型肝炎血浆模型进行生物人工肝的体外实验，为临床应用提供理论基础；结合血浆置换与生物人工肝装置，构建一种新型稳定安全的混合型人工肝支持系统，并应用于临床，验证其有效性及安全性；对混合型人工肝系统可能引起的PERV传播的生物安全性闽题进行探讨。】．猪肝细胞的高质量分离和培养采用改良两步胶原酶灌注法分离猪肝细胞，接种至培养瓶中培养1~7d，动态观察肝细胞活率、葡萄糖合成功能、安定转化功能、上清中自蛋白、LDH浓度，倒置相差显微镜、电镜观察培养肝细胞结构。结果显示肝细胞总数达1．5士0．4x10

3、10／整肝，经台盼兰染色活率达92-士5％。肝细胞活率随培养时间的延长逐渐下降。经1d-Td培养后上清液中ALT、AST、LDH的含量随培养时间的延长显著下降(P<0．01)；而Alb和GloB的合成随着培养时间的延长逐渐上升。肝细胞培养上清中合成的葡萄糖浓度在1～8h内逐渐上升，以培养ld的肝细胞合成葡萄糖能力最强，3d、5d、7d葡萄糖合成能力达到一个稳定水平。培养肝细胞在3d安定转化功能最强，此后随时间延长丽降低。电镜观察培养1天后肝细胞问22003浙江大学博士学位论文形成紧密连接和极性。本研究表明，新鲜分离的肝细胞在经2～3天的培养后无论在形态学还是功能

4、学均处于最佳状态。为此我们建议在临床应用分离肝细胞作治疗时，最好选择经培养2～3天后的肝细胞，以便发挥其最大功能。2．使用重型肝炎血浆模型进行生物人工肝的体外实验收集重型肝炎血浆置换术患者的被置换血浆，作为生物人工肝治疗的血浆模型。将获得的总量约5×109活率在90％以上的猪肝细胞置于TECA．I型中空纤维管式生物反应器中预培养4～6h，肝细胞循环流经中空纤维管的外管腔。生物反应器膜为混合纤维素纤维，孔径200nm，分子截留量为100kD。将收集到的重型肝炎患者血浆2000ml通过国产蠕动泵的驱动循环流经中空纤维管的内管腔进行体外循环共3h。生物人工肝对体外重型

5、肝炎患者血浆进行3小时的循环处理后，总胆红素有明显下降(P<0．05)。其余指标未见统计学意义，此外，血浆中钾、钠、氯、钙等电解质水平亦无明显变化。实验前肝细胞活率平均为92．3±2．4％，实验后肝细胞活率明显下降，变为73．6士10．3％，这与重型肝炎血浆中含有大量毒索经半透膜对猪肝细胞产生损害有关，也证明了混合型人工肝先置换去毒再行生物人工肝治疗的设计方法的正确性。应用重型肝炎患者的被置换血浆作为重型肝炎模型研究生物人工肝对重型肝炎的疗效，简便易行，值得推广应用。3．混合婆1人工肝支持系统的构t及临床应用我们在前述猪肝细胞分离及培养的实验基础上，结合血浆置换

6、和生物人工肝，选择中国实验用小型猪为肝细胞供体，构建了一种新型的混合型人工肝支持系统，治疗15例重型病毒性肝炎患者。每次治疗后患者临床症状不同程度减轻，乏力、腹胀明显改善，腹水减少。总胆红素在HALSS治疗后有明显下降，PTa上升，缬氨酸有明显升高。与非生物型人工肝治疗组比较治疗后3天的生化指标2003渐n人学博士学位论义改变，发现总胆红素、直接胆红素、凝血酶原活动度、内毒素较单纯血浆置换组下降明显(P

7、；l例患者经过混合型人工肝支持治疗后成功地等到了供肝。进行了肝移植并存活至今；4例患者病情未好转死亡。所有患者在治疗中及治疗后12小时内未出现严重不良反应，除1例患者在治疗中出现轻微过敏反应，经对症处理后得到纠正，并继续接受混合人工肝支持治疗。我们构建的混合性人工肝支持系统对于慢性重型肝炎是一种安全有效的辅助支持和治疗手段，值得进一步扩大病例数进行深入临床应用研究。4．HBLSS治疗中猪内源性逆转录病毒(PERv)感染的研究留取猪肝细胞在中空纤维反应器内的培养上清，15例病人治疗前后血清，8例病人治疗后3周的血清，进行PERVPCR及RT-PCR测定。检测混合型

8、人工肝支持系统术前病人的