DNA聚合酶κ和DNA聚合酶η在烷化剂MNNG引起的非定标突变中的作用

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1、浙江大学硕士学位论文DNA聚合酶κ和DNA聚合酶η在烷化剂MNNG引起的非定标突变中的作用姓名：罗月球申请学位级别：硕士专业：生理学（病理生理学）指导教师：余应年2003.5.1塑翌查兰兰垡堡塞兰旦堡一一——～缩略语(Abbreviations)DEPC：DiethylpyrocarbonateDEX：DexamethasoneDMSO：DimethylSulfoxidedNTPs：DeoxyribonucleosideTriphosphatesDTljDi协iothureitolEB：EthidiumBromideEDT

2、A：DisodiumEthylenediaminetetra-acetateIPTG：Isopropylthio一昼一D—galactosideLB：Lufia-bertanimediaMEM：MinimumEssentialMediumMNNG：N-methyl—N’-nitro—N-nitrosoguanidinePBS：phosphate—bufferedsalinePol：DNApolymeraseSDS：SodiumDodecylSulfateTE：Tris．EDTATALE："Iris-acetate／EDTA

3、electrophoresisbufferX-gah5-bmmo-4一chloro一3-indolyl-13一D—galactosideTLS：TranslesionsynthesisXUTM：Xphageuntargetedmutagenesis2浙江大学学位论文罗月球DNA聚合酶K和DNA聚合酶rl在烷化剂MNNG引起的非定标突变中的作用浙江大学生理学2000级硕士研究生：罗月球导师：余应年摘要fDNA经常遭受内源和外界环境因子的攻击，造成DNA损伤，大部分的损伤＼是奇以被无误的DNA修复机制消除的，但也有一些损伤会因

4、为在复制过程中没有被修复而在染色体上继续存在，如发生在s期的损伤、一些比较大的损伤、染色体组上的损伤和一些不容易被修复的损伤会，此时DNA聚合酶会在损伤处停顿，DNA复制不能正常进行，从而影响细胞的分裂，更为严重的会导致细胞的死亡。作为对这些损伤的反应，细胞体内发展了一种损伤耐受机制，使DNA遭受严重损伤时，复制还能继续进行，跨损伤合成机制就是其中的一种㈣，61。跨损伤合成可分为两类，无误(error-free)跨损伤合成和易误(error--prone)跨损伤合成。跨损伤合成需要一类特殊的聚合酶来完成，原核生物和真核生物

5、(包括人)中参与跨损伤合成的酶有多种，包括原核细胞的DNA聚合酶Iv、v和真核细胞的DNA聚合酶K、rl、t、REVl等，由于这些酶在进化上的保守性，统称为UmuC超家族。DNA聚合酶‘也参与跨损伤合成，但不属于UmuC超家族【31。E．coli中，损伤诱导的突变由SOS反应诱导产生的DNA聚合酶V来完成。DNA聚合酶V由UmuD'2C蛋白复合物组成，其中UmuC具有催化活性。在SSB、RecA存在下，polV的跨损伤合成能力增强，导致SOS定标性突变(SOStargetedmutagenesis)。当复制未损伤的DNA时

6、，polV也表现出高突变性并且易形成嘌呤一嘌呤、嘧啶一嘧啶错配【4l，导致SOS非定标性突变(SOSnon(un)targetedmutagenesis)。大肠杆菌E．coliSOS反应还启动dinB基因，编码polIV,polIV缺少3’-->5’外切酶活性，是低保真度聚合酶，参与入噬菌体的非定标突变(九UTM)，polIV过表达，F‰质粒的移码突变和碱基替换突变都上升[5,6,71。在小鼠和人中发现了DinB基因的同源物，分别命名为Dinbl和DINBl。浙江大学学位论文罗月球DINBl编码的蛋白为PolK，是真核生物

7、中一类新的跨损伤合成酶。体外实验中，不能跨过Uv损伤(cis．synTT和6--4TTdimer)、顺铂加合物(cisplatinadduct)，但能有效跨过8一氧代鸟嘌呤，在它对面插入碱基A，在AP位点大多也会插入碱基A，继续延伸的话，会插入碱基T，导致一1移码突变。在乙酰氨基芴(AAF)修饰的G模板对面往往插入碱基c，少数情况下会插入A。在苯并芘(benzo(Ⅱ)pyrene)修饰的碱基G对面插入正确的碱基C。将Dinbl基因的cDNA瞬时转染入小鼠细胞中，发现突变率升高了10倍【8，9】。最近人们意识到PolK可能与

8、遗传不稳定的发生有关，因此我们在本课题中研究了PolK与非定标突变的关系。Poln(DNApolymeraseeta)也是UmuC超家族的一个跨损伤聚合酶。Poln能在cis—synTT对面插入正确的碱基，(6-4)TT却不能被正确修复。同时人们还发现Poln在复制未损伤的DNA时，具有比其它已发现的其