植物病毒鉴定检测方法的研究进展

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1、植物病毒鉴定检测方法的研究进展--------------------------------------------------------------------------------随着现代病毒学近半个世纪的发展历程，病毒的检测手段和方法也在不断发展和改进，但无论是什么样的方法，都是根据病毒所共有的两个特性而发展起来的，一是病毒的侵染性，二是病毒作为核蛋白的特性，也就是病毒理化性质。1．枯斑和指示植物检测法植物病毒最方便的测定法是利用受病毒侵染能产生枯斑的寄主植物进行检测病毒，此法是美国病毒学家霍姆斯(Hohnes)在1929年发现的，用感病的植物叶片与少许金刚砂相混

2、，研磨成粗汁液，然后在指示植物的叶片上蘸取汁液，磨擦供试植物的叶片，经清水清洗后，置于室温条件下的温室内待测，2-3d后叶片上会出现局部坏死灶，即圆形的枯斑，在一定的范围内，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比。枯斑法虽不能测出病毒总的核蛋白浓度，但能测出病毒的相对侵染力，对于病毒的定性有着重要的意义。诺贝尔奖获得者美国科学家斯坦利(Stanley)第一次提纯出TMV(烟草花叶病毒)时就是使用此法来检测病毒的。时至今日，很多试验室和生产检测单位仍然利用此方法检测病毒。枯斑法在提纯一个未知病毒时，它还可起到追踪病毒踪迹的作用，一旦有了病毒的纯品，利用病毒的稀释曲线，可以换算出病毒的实

3、际浓度。2．血清学检测法基本原理是动物受其致病细菌、病毒侵染后，动物体内血液中的球蛋白发生变化而产生抗体，引起动物产生抗体的物质简称为抗血清。血清中的抗体能与同系的抗原在体外特异的结合，这一特性就是血清学测定病毒的基本原理。这种方法已经广泛应用于植物病毒的定性定量分析和医学临床诊断上，其方法的种类也很多，这里仅对一些重要的方法做扼要的介绍：(1)补体结合测定法。血清中有一种对热不稳定的成分，它能在抗体存在的条件下，溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌，这种成分就称之为补体。补体是一种很复杂具有酶活性的蛋白质，在560(；下加热，30min后补体则失活，它的一个重要特性是一旦抗体与抗原

4、结合，则补体也与之结合，通过补体的酶作用可以溶解红细胞。(2)沉淀法。相对来说沉淀法即非常简便，在植物病毒学中应用的极为广泛，其原理是在电解质存在时，抗体与同源抗原相互结合形成沉淀，不同病毒类型所形成的沉淀也不同。如杆状、线状病毒形成絮状沉淀，球形病毒多形成颗粒状沉淀，通过稀释终点法，就是利用抗原稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点，来测试病毒的浓度。3．酶标免疫吸附法(ELISA)Elisa方法是Enzyme-Linkedimmunosorbentassay的缩写，最早用于动物病毒的检测，近二三十年才应用于植物病毒的检测，并作为病毒的定量方法广泛应用于病理、免疫学的

5、研究和生产实践中，对病毒进行快速检测。此法的最大优点是灵敏度高，能与放射免疫技术媲美。有很多的病毒因其浓度太低或某种抑制剂的干扰，常规血清学方法检测不出时，此法就显示出独特的优越性。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入酶标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。4．电镜负染检测法第一台电子显微镜的诞生打开了人类认识微观世界的大门，电镜技术在近70年发展历程中，为生物学、细胞学、病毒学领域的发展作出了重要贡献。正是由于电镜的出现，实现了人类

6、可直观病毒及其他生物大分子的可能。因此电子显微镜技术可以说是最直接，最准确的检测病毒的手段，它可以直接看到病毒的形态结构、存在与否，所以在进入了分子水平的今天它仍然有着不可替代的作用。电镜负染技术是20世纪60年代开始使用于英国试验室，当时人们发现一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，其图像如同一张照相的底片，因此人们习惯地称为负染色，电镜负染技术也就由此而生。5．免疫电镜检测法免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，在电镜制样过程中，病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察时

7、的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一特点，在电镜制样过程中，于铜网上先铺展一层细胞色素A，稍后再添加一滴抗体，多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液，由于细胞色素A的作用，减少了样品即抗体、抗原的表面能力，能形成均匀的涂层，再加抗体、抗原的吸附作用使病毒能较集中地沉集在有效视野内，从而便于电镜下的观察，大大提高了检测几率。6．电镜超薄切片法该技术的发展已经达到病毒的体内定位研究和体内复制及侵染过程的动态研究水平，并能直观病毒生物大分子的亚基单位，已经从细胞水平发展到分子水平。尤其