外周血白细胞端粒DNA长度与年龄相关性的研究

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1、中山大学硕士学位论文外周血白细胞端粒DNA长度与年龄相关性的研究姓名：陶黎阳申请学位级别：硕士专业：法医学指导教师：胡丙杰;刘超2003.5.8中山大学硕士学位论文外周血白细胞端粒DNA长度与年龄相关性的研究专业：法医病理学硕士研究生：陶黎阳导师：胡丙杰副教授刘超主任法医师中文摘要f年龄推断(ageestimation)一直是法医学上的重点及难点。寻找一种客观、精确的年龄推断方法是百余年来法医学者们一直努力研究的方向。目前法医学年龄的推断主要从形态和化学两方面考虑。形态学的方法受个人的主观影响较大只有经验丰富者才能得出好的结果，而化学的方法则需要对检材进行特殊的处理

2、，同时这些方法在检材方面均受到一定的制约，例如实际案件中的血迹等斑迹检材或碎尸案件中一块皮肤和肌肉等软组织检材用上述方法显然难以奏效，因此两种方法的实际应用都受到不同程度的限制。端粒是真核细胞线形染色体末端的一种特殊DNA一蛋白质结构，其功能是维持染色体的稳定．使染色体免遭融合、重组和降解。近年来又发现它与细胞的永生化稠衰老有着密切的关系，由于末端复制问题和可自＆存在的核酸外切酶对染色体末端的消蚀作用，伴随着细胞的分裂增殖染色体末端端粒结构会逐渐缩短，当短到一定程度时衰老或永生化就不可避免地发生了。有关衰老以及肿瘤等疾病与端粒消蚀的相关性国内外均有不少文献报导，月c

3、实验拟从法医学的角度，探讨端粒DNA长度与年龄之间的关系，选择法医学中最易获得的检材一血液标本作为研究对象，用非同位素标记的探针代替同位素标记的探针进行Southern印迹杂交，定量检测外周血白细胞端粒长度的增龄性变化规律，试图在从血液、血痕、皮肤、肌肉等组织来推断年龄方面有所突破，为法医学年龄的推断找到一个精确、客观的新方法。f材料和方法中山大学硕士学位论文收集0～72岁之间共120例不同健康个体的静脉血和新生儿的脐血．．70。c冰冻保存。常规酚一氯仿抽提基因组DNA，紫外分光光度计测定DNA样品的纯度和浓度，含EB的O．8％琼脂糖微型胶判断所抽提基因组DNA的长

4、度，1．5pg基因组DNA用限制性核酸内切酶HinfI和RsaI消化过夜，0．8N琼脂糖凝胶80V电泳5～6h，冷却电泳体系并不停交换正负极缓冲液，上样时包含两种高分子量DNA对照Marker，真空转膜，阳离子尼龙膜紫外交联3min．420c水浴预杂交、杂交，2XSSC、0．I％SDS洗膜5min×2，0．2XSSC、0．19kSDS50。C洗膜lh×2，阻滞30～60min，地高辛抗体孵育30min，X一线片曝光5～20min，积分光密度扫描后用端粒DNA长度分析软件计算端粒DNA平均长度(TRF值)，将图像分析所得的数据输入MicrosoftExcel数据库．应

5、用美国社会科学统计软件包(statisticspackageofsocialscience，SPSS)对数据进行统计学处理。结果一、基因组DNA的抽提、酶切结果抽提的基因组DNA样品绝大多数260nto和280hm处的oD值之比介于1．7～1．9之间，浓度大于或等于0．1鹏巾1，o．8％的微型琼脂糖凝胶电泳，用ffind—III酶切xDNAMarker作对照，观察到所抽提基因组DNA保持高分子结构(片段大于23．2Kb)．按本实验方法抽提的基因组DNA适合于做Southern印迹杂交。限制性核酸内切酶酶切过夜后样本电泳呈均匀瀑布样分布，无酶切不全现象。二、South

6、ern印迹杂交结果x线片曝光后见杂交谱带清楚，背景低，不同年龄组间有所差别。经积分光密度扫描后，用端粒长度分析软件计算不同个体的端粒DNA平均长度．(结果见表1)。表1．各年龄组的端粒DNA平均长度中山大学硕士学位论文l～142215。03～11．7L13．3215～241513．48～12．0712．6725～341613．1l～n．0712．1l35～4445～5455～64>64171416912．40～lO．7412．55～10．3111．8l～10．2311．59～9．6711．5911．2910．9710．52三、统计学分析用SPSS统计软件包对实验数据

7、进行线性回归分析，得到年龄关于端粒DNA长度的回归方程：Y=202．863—14．009X(R2=0．773，F=402．071．P