鸡新城疫病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究

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1、黑龙江八一农垦大学硕士学位论文鸡新城疫病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究姓名：冉旭华申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：崔玉东2003.6.1鸡新城痤病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究中文摘要f～新城疫(N曲瑚sIIedisease,ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的鸡急性、高度传染性疾病。NDV是副粘病毒}4(Papramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Rubulavirus)成员。病毒核酸为单股、负链、不分节段的RNA。NDV能在鸡胚成纤维细胞(chickenembryofibroblasts，CEF)上生长，并

2、产生细胞病变(cytopathiceffeet，CPE)。近年来的研究发现NDV感染后．除了导致组织损伤、细胞病变、细胞融合外，还能诱导宿主细胞凋亡。已经证实NDV感染后能通过干扰素和耵嘎途径诱导细胞凋亡，但能否通过Caspases途径诱导感染细胞凋亡尚未见报道。y本研究应用不同的QlsDas瞄抑制剂玉VAD．rink、Z-DEVD．rink、Z-IETD，fmk、Z-LEHD．fmk、Z-AEVD．rink研究了参与NDV．Mukteswar株诱导CEF凋亡的caspases，确定了NDV可以通过Casrmes依赖性途径诱导CEF凋亡。同时还研究了NDV弱毒株Clon

3、e-30诱导CEF凋亡的情况。为进一步了解NDV的致病机制，将来在临床上更好地预防和治疗ND提供理论参考。f为确定NDV中等毒力毒株Mukteswar诱导CEF凋亡，首先将病毒以5001"C’ID50的浓度感染CEF，72h后进行形态学检查和DNA片段化分析。结果NDV感染使细胞之间的连接消失，染色质浓缩断裂，细胞膜内陷，凋亡小体㈣p幻dcbody)形成，基因组DNA断裂成188bp左右及成其整数倍的片段、琼脂糖凝胶电泳呈现典型的凋亡带．即DNA梯形电泳带(1adder)。这表明NDV能够诱导CEF凋亡。为确定病毒诱导细胞凋亡的有效浓度及细胞凋亡的时间进程，将Mukte

4、swar株以500TCID50的浓度感染细胞，分别提取感染后12、24、36、48、60、72h的细胞基因组DNA，进行DNA片段化检测分析，结果在感染后48h，DNA琼月旨糖凝胶电泳出现明显的梯形电泳带扫{后，将病毒分别以100、150、200、250、300、400TCID50的浓度感染细胞，培养48h后进行DNA片段化检测分析，结果确定该病毒以200TCID50浓度接种为宜。以上结果表明，以200TCID50的病毒浓度感染CEF、在感染后48h时检测凋亡细胞的基因组DNA片段化为佳。Caspa3eS的活化是细胞凋亡的关键。为了解在NDV诱导CEF凋亡的过程中是否有

5、Caspases参与，在NDV．Mukteswar接种CEF前2h用Casoases抑制剂Z-VAD处理细胞，接种病毒后进行形态学检查与DNA片段化检测分析，结果Z-VADrink对凋亡有明显的抑制作用，这表明NDV通过Caspases途径诱导细胞凋亡。在试验中还发现在使用抑制剂时虽然抑制了凋亡的发生，但病毒仍引起细胞病变，而且病黑龙江八一农垦大学硕士学位论文毒的毒价也无显著变化。试验进一步使用easpase一3、caspase-8、c．aspa,se．9、caspase-10的抑制剂分别处理细胞。结果caspase-8的抑制剂Z-IETD．rink和caspase．9

6、的抑制剂Z-LEHD．rink对凋亡有明显的抑制作用。而caspase．3的抑制剂Z-DEVD．fmk和caspase-10的抑制剂Z-AEVD．rink对凋亡没有抑制作用。这说明easpase-8、caspase一9在NDV．Mukteswar株诱导CEF凋亡的过程中发挥重要的作用。试验还研究了鸡NDV弱毒株Clotle30诱导细胞凋亡的情况，结果表明CEF凋亡，说明不同毒株不但引起细胞病变的情况不同，引差别。V-MukteswarCaspases途径诱导CEF凋亡，凋亡途径中caspa妊8、caspase-9发挥重要作用。且Caspases抑制剂虽然能抑制凋亡，但对

7、病毒增殖与病毒毒价没有影响，而NDV--Clone30株不能诱导CEF凋亡。关键词：新城疫病毒；鸡胚成纤维细胞；细庸稠亡；Caspases途径、，’'／t／、／鸡新城疫病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究引言1966年Satmder首次提出程序化细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)的概念，并指出PCD是细胞生理性死亡，是生物进化过程中在自然选择压力下形成的有利于生物体生存的机制。1972年英国学者Kezr光镜和电镜观察提出凋亡概念用以描述这种形态学上有别于细胞坏死的细胞死亡过程，细胞凋亡不引起炎症反应[31，从此开始了有