蛇毒抗肿瘤成分的筛选及对人肿瘤细胞抑制作用的研究

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1、中国医科大学博士学位论文蛇毒抗肿瘤成分的筛选及对人肿瘤细胞抑制作用的研究姓名：孙晋民申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：辛彦2003.3.1蛇毒抗肿瘤成分的筛选及对人肿瘤细胞抑制作用的研究中文摘要前言恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病。在我国每年至少有160万新增癌症患者，而且每年约有130万人死于癌症，随着人口数量的增加和人口老龄化的加快，肿瘤发病率和死亡率也呈上升趋势。因此肿瘤的防治工作一直是我国医药卫生领域的重点，寻找安全有效的药物是肿瘤治疗中的重要课题。近年来动物来源药物越来越受重视，充分利用我国动物资源开发新的抗肿瘤药物，成为肿瘤研究领域的重要内容。迄今关于蛇毒神经生长因子抑瘤

2、作用，国内尚未见报道。蛇毒神经生长因子(ner'vegrowthfactor，NGF)是由蛇毒精制而成单一成分的生物制剂。国外已有报道许多体内外实验均表明，NGF对肿瘤的生长具有抑制作用，但其确切抑瘤机制尚在研究中。内皮素(endothelin，ET)是由血管内皮细胞等合成的一种活性多肽，是迄今为止所发现的最强的缩血管物质。ET作为生长因子能够以旁分泌和自分泌作用刺激癌细胞的异常增生，与肿瘤的发生、发展有关。但NGF对小鼠14_22抑制作用如何，这一作用与El'之间是否存在联系，尚待深入研究。为此，本研究首先筛选分离出长白山地区白眉蝮蛇毒的抗肿瘤成分，并对其体外、体内抗肿瘤作用及可能的机制

3、加以研究。目的1、筛选并探讨长白山地区白眉蝮蛇(Agkstrodonhalysussuriensis)毒抗肿瘤成分。2、探讨蛇毒神经生长因子(NerveGrowthFactor，NGF)对体外培养人肿·1·瘤细胞增殖的抑制作用。3、探讨神经生长因子(NGF)对小鼠腹水瘤H22的抑制作用以及与血浆内皮素含量的相关关系。方法1、经CMC．SepharoseFF、SephacxrlS-200等层析法从长白山地区产白眉蝮蛇毒中分离纯化获得抗肿瘤成分，通过检测发现该成分为神经生长因子(NGF)。2、采用噻唑蓝(M，n')法、台盼蓝拒染法和集落形成作为观察指标，以NGF(5、10、15、200ee'r

4、nl)处理4种人肿瘤细胞(人白血病细胞株‰、人胰癌细胞株JF305、人肺癌的胞株AGZY-83a和人胃癌细胞株MG-803)，选用不同作用时间，分别观察NGF对上述细胞的影响。阿霉素(DXR)为阳性对照药。3、用不同剂量(5、10、20ta,g／kg)的NGF对荷腹水瘤H22小鼠进行治疗，观察其对小鼠腹水瘤I-122的影响。4、各组小鼠皮下接种14．22细胞，治疗方法同前。利用放射免疫测定法(R认)测定荷瘤小鼠血浆内皮素(ET)含量，观察NGF对ET含量的影响。结果1、实验证实抗肿瘤成分为NGF，经SDS—PAGE实验，证实NGF分子量为16．8KD，对小鼠腹水瘤H22有抑制作用，能使荷瘤

5、小鼠生命延长率提高达62．2％。2、NGF对K。、JF305、AGZY-83a和MG-803细胞均有细胞毒性作用，K，。和JF305比后两者显示出更好的量效关系(r=0．9726，r=0．9768，P<0．05)。NGF处理K锨和JF305细胞24h，48h和96h后，两种细胞的生长均受到抑制(P<0．05，P<0．01)并有显著的剂量效应关系，处理JF305细胞24h、48h和96h，NGF的IC∞分别是17．891aeJml、10．609,g／ml和13．42t培／nd，时间．效应关系亦明显；处理K562细胞的Ic50分别是18．2509ml、9．10lag／ml和14．36p,g／m

6、l，NGF对K562细胞的生长抑制作用以48小时为显·2·簧。另外NGF还可显著抑制JF305细胞的集落形成，并餐职显的量效关系(r=O．9869，P<0．01)，其I％为12．860e，／'ml。3、NC-F大剡量缰对小鼠腹水瘸I／22有明显的抑制作用(抑瘤率46．36％)。荷H22腹水瘤小鼠ET水平明显高于对照组(P《0．05)，大剂萤组小鼠血浆ET禽量明显降低(P<0。05)。讨论在挽翳癯药物筛选程研究孛，倦外翼孛痰缨胞培养窥动物实验居重要地位，采用体外细胞培养方法筛选抗肿瘤药物时，检测的终点指标包括细胞的生存裁力检测粳生长能力测定嚣个穷嚣，鼹者的检测常采用MTr法，后者的检测常采用

7、榘落形成能力实验，细胞计数，蛋白质或其它大分子物质含量测定等。嚣者终合毙客双地反应被测魏器的药联俸用。MTr法是一种快速、简便的颜色反应的测定方法。哺乳类动物细胞的线粒体内琥珀酸脱氢蕊可将黄绿色鹃MTr降解成蓬紫色的乎黢(formazan)，应用酶联免疫梭测仪测定甲臌的禽量，可以定量测定细胞存活的比例，1983年Mosmann簿首次将MTr原理应用予免疫法熬缨腿毒性测定。1987年carmichnel等将j比方法用乎体外