盐泽螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的分离纯化及其抑制肿瘤活性的初步研究

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1、南京师范大学硕士学位论文盐泽螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的分离纯化及其抑制肿瘤活性的初步研究姓名：马宇翔申请学位级别：硕士专业：微生物指导教师：李建宏;张成武2003.5.1声明尸I刃本人郑重声明：1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：日期：马寺麴司，2003．5硕士学位论文

2、摘要本文主要研究了以下内容：①研究了盐泽螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的最佳获取条件。②分离纯化藻蓝蛋白和多糖，得到纯藻蓝蛋白c．PC和纯化多糖SP，并对c．PC和sP进行纯度鉴定和组成分析。③从体外肿瘤细胞、小鼠黑色素瘤模型及小鼠免疫系统三方面着手，对藻蓝蛋白、多糖及其纯化产物c—PC、SP抑制肿瘤的活性作了初步的探讨。为了最大量的获取藻蓝蛋白和多糖，进行了两者最佳获取条件的研究，并得出了初步的结论。在本实验中K2HP04和NaCl浓度的变化对藻细胞的c．PC和租多糖含量影响不明显。根据本实验结果：盐泽螺旋藻培养的光强应为40001ux以上，光暗周期为14：

3、10，培养基中NaHC03浓度为59／L，NaN03浓度为2．59／L，在稳定后期收获藻体并提取藻蓝蛋白、多糖。(自制羟基磷灰石(HA)柱，分离纯化藻蓝蛋白，经SephadexG一100柱层析、、紫外可见光扫描、PAGE电泳等实验方法的鉴定，表明已经得到纯化的藻蓝蛋白(c．PC)。经SDS-PAGE电泳鉴定其亚单位，得知它含d、B两个亚单位，推测两个亚基的分子量分别为16kD、20．5kD左右。所以推算c-PC的最小分子量为36．5kD左右。热水抽提藻体，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)沉淀，脱蛋白后，经DE一52柱层析，收集主峰峰尖部分，透析浓缩后乙

4、醇沉淀。SephadexG一100柱层析鉴定其纯度，获得纯化组分为SP，并对其组成和初级结构怍了初步的分析。sP的分子量为11300Dt。SP含有葡萄糖醛酸和葡萄糖胺，为粘多糖。单糖纸层析显示：sP至少含有D一葡萄糖、D一木糖、葡萄糖醛酸和盐酸氨基葡萄糖。o通过体外细胞实验发现粗藻蓝蛋白、粗多糖及c—PC、SP，可以选择性的抑制肿瘤细胞的生长，并能够显著的促进正常细胞的生长。粗藻蓝蛋白和c—PC的光敏实验表明：在碘钨灯照射下，粗藻蓝蛋白和c—PC比未经光照更有效的抑制肿瘤细胞的生长，而对正常细胞无抑制作用。通过对黑色素瘤A375细胞形态的观察，发现加

5、样后，细胞周围产生凋亡小体；结合Hochest染色和细胞膜磷脂酰丝氨酸荧光显示方法，我们初步认为藻蓝蛋白和多糖是通过促进肿瘤细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的生长。我们成功建立了ICR小鼠的黑色素瘤模型以验证体外细胞实验的结果，并硕士学位论文摘要进行了样品对小鼠免疫活性的研究。在小鼠肿瘤模型实验中，我们发现给粗藻蓝蛋白和粗多糖组2周后肿瘤有明显的减小甚至消失，单纯的螺旋藻对肿瘤的抑制不明显。两组免疫实验表明粗藻蓝蛋白和粗多糖及c．PC、SP对小鼠免疫系统没／有显著促进作用。l而大多数文献表明，藻蓝蛋白和多糖可以抑制肿瘤是通过促进、免疫系统起作用的，‘与本文结

6、论不一致。由于时间所限，我们只作了两个免疫小实验，也许样品可以促进免疫系统的其它方面，待进一步实验验证。、】产关键词：盐泽螺旋藻j藻蓝蛋白，多糖芦中瘤模型，免疫活性硕士学位论文摘要AbstractStudieshaveshowedthatSpirulinahaspotentialhealthyandtherpeaticaffectsbecauseofthepresenceofphycocyanin，polysaccharideandothercompositions．Thecomposition，physicochemicalpropertiesan

7、dpartoftherapeuticeffectsofphycocyaninandpolysaccharidewerestudiedinthisresearch．①WestudiedthebestconditionstogetthephycocyaninandpolysaccharideofSpirulinasubsalsa．②Bypurifyingthecrudephycocyaninandcrudepolysaccharide，wegotc-PCandSEWeidentifiedthepurityandanalyzedtheircompositi

8、on．③Bythestudyofvitrocellexperiments、theimmunesystemof