实验16-酶切与连接

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1、实验十限制性酶切与连接一种能够结合外源DNA片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA分子称为Vectors.主要载体：质粒、噬菌体、病毒按功能分类：克隆载体（构建基因组文库或cDNA文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。载体（Vectors）结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位由pUC18改造而来，大小为3162bp。相当于在pUC18中增加了带有M13噬菌体DNA合

2、成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。（二）材料模板DNA引物：APOA1-GST2(载体：pGEX-6P-1)PrimerGST6p1-APOA1-Up:5’GGAATTCATGGATGAACCCCCCCAGAGCC-3’EcoRIPrimerGST6p1-APOA1-down:5’CGCGTCGACTCACTGGGTGTTGAGCTTCT-3’SalI粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G

3、AATTC……3’3

4、’……CTTAA

5、G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。一、DNA的限制性酶切实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分

6、为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。1.限制性内切酶的类型第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就

7、是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出、３’端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。1.限制性内切酶的类型限制性内切酶酶分子识别位点切割位点限制作用是否需用ATPⅠ类三亚基双功能酶二分非对称至少在识别位点外1000b

8、pYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多数为回文对称结构在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶5-7bp非对称在识别位点下游24-26bpYesⅡ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出、３’端突出和平末端。限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G

9、AATTC……3’

10、3’……CTTAA

11、G……5’在双链上交错切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT

12、ATC……3’3’……CTA

13、TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。平头末端：用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种

14、名称，如E.coli用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ,Hind