米黑霉脂肪酶活性的高通量筛选方法及其固定化和应用的研究

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1、⑨论文作者签名：卅指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：委员5：答辩日期：圣!!!玺塑兰旦Author’Ssignature：一‘●‘bupervisor7Ssignature：Thesisreviewer1：Thesisreviewer2：Thesisreviewer3：Thesisreviewer4．Thesisreviewer5：Chair：(Committeeoforal㈣Committeeman1：Committeeman2：Committeeman3：Commit

2、teeman4．Committeeman5：Dateoforaldefence：浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：孑丹签字日期：≥汐72年弓月歹日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙婆太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印

3、件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：乏只导师签名：签字日期：翮≯年弓月<日签字日期：’一，日浙江大学硕士学位论文致谢致谢本课题是在我导师于教授(于洪巍)的悉心指导下完成的。记得刚进实验室的时候，于老师跟我说人生经历就是一种财富，人应该踏踏实实的做事情，只要努力自然就会有回报。这像一盏指明灯，教我如何应对人生。在最初选题、解决课题问题、购买仪器、撰写文章与修改等事情上，都得到

4、了于老师殚精竭虑的帮助和支持。从他身上学到的认真严谨、尽心尽责、刻苦努力、不折不挠的精神对我今后的个人发展起到了重要作用。在生活中，于老师更像一名慈父，对我们关怀备至，让我们有了一个大家庭的感觉。感谢王博师兄在实验和生活方面给予我的认真指导和帮助，在他的协助下解决了我许多入门时的疑惑，并在我发表论文的撰写与修改上提供了许多宝贵意见。感谢一直在我身边陪伴我的王珏同学，不论发生什么事情都能理解我、帮助我，她的细心和努力很值得我学习，我们相处很愉快。感谢刘击、刘敏、麻静波、姜灵、顾佳黎、陆文强、吕小妹、徐红娜、魏笑莲、刘悦以及新和成公司职员张兵、费云舟、何帅

5、伟，感谢你们一同营造了良好的实验室氛围，伴我度过了一段愉快且有意义的科研生活。感谢室友和身边的朋友们对我的照顾和关怀，使我度过一个又一个惬意的周末。最后，感谢我父亲母亲等家人对我的支持和关爱!王丹2012年1月10日浙江大学硕士学位论文摘要摘要脂肪酶即甘油酯水解酶，是一类专门水解油脂的酯酶。脂肪酶广泛应用于化学合成、食品、医药卫生、环保和能源开发等领域。其中来源于真菌米黑霉的脂肪酶RML(RhizomucormieheiLipase)是1，3．位专一性的脂肪酶，可以有效得制备各类油脂。在本文中，首先介绍了检测脂酶活性的几种方法及RML的一些酶学特性。其

6、中p-NPP法只适合检测低酶活的脂酶；醋酸铜法和碱滴定法各有优缺点，但都适于检测脂酶酶活。RML在温度35．38oC，pH8．10之间表现出较好的活性。Cu2+抑制RML的活性，而Ca2+和M92+都能促进RML的活性。其次，开发了一种以橄榄油为催化底物的高通量筛选方法，并用于脂肪酶RML的定向进化。这个高通量方法的原理是利用脂肪酸和氯化钙反应生成可以通过pH指示剂检测的盐酸。与传统的p-NPP法比较，这个新方法展现了很多的优点：首先反应真实底物的活性；其次克服了p-NPP方法只能检测低酶活的缺点。新方法筛选出的突变酶，通过滴定法及液相检测，发现活性确

7、实有所提高，而用P．NPP法筛选出的突变酶却不完全一致。通过运用该方法，RML经两轮定向进化后，我们成功筛选到酶活提高了5倍的优势菌。另外，脂酶的酯化活性也会随着水解活性提高。脂酶RML的1，3．位专一性没有改变。磁性纳米颗粒因其生物相容性、稳定性、特殊磁性和比表面积大而受到广泛的关注。通过丙烯酸乙酯与磁性Fe304的共聚反应，建立了一个在磁性纳米载体上共价结合固定化酶的方法。因为这个方法利用叠氮基固定化酶，不接触任何化学物质，所以避免了酶失活等问题。每克Fe304酶的装载量达到250毫克，而且保留活性为100％左右。即使重复使用10次，活性仍不变。l

8、，3．甘油二酯(1，3．DAG)由于其广泛用途，尤其是对身体健康方面的作用而日益受到人们的重视