人结核杆菌热休克蛋白65重组BCG疫苗的构建、表达及鉴定

《人结核杆菌热休克蛋白65重组BCG疫苗的构建、表达及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、华中科技大学同济医学院硕士学位论文摘要目的：构建大肠杆菌一分支杆菌分泌型原核穿梭表达质粒(pBcG—SP)。将结核分支杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)的全长基因克隆入这个新型的载体，并将其导入耻垢分支杆菌和BCG中表达．构建人结核杆菌HSP65重组BCG疫苗，为我室下一步的研究工作奠定基础。方法：用PCR技术从BcG基因组中扩增出抗原85B(A985B)的信号肽DNA序列，从pCMVMTHSP65质粒中扩增出HSP65全长基因。信号肽DNA序列用BamnI和Nsil分别消化，HSP65DNA序列用Nsil和Kpnl分别消化。同时

2、制备大量的表达载体pBOG-2100，用BamHI和KpnI消化。利用基因重组技术构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒(pBCG-SP-HSP65)。利用电穿孔的方法将该质粒分别转入耻垢分支杆菌和BcG中，经热诱导后，用SDS—PAGE电泳来观察其表达水平。利用western-blot来检验HSP65的生物学活性。／结果：PCR扩增出120bp的信号肽DNA片段和1600bp的热休克L{}_自喝5DNA片段，并插入到原核穿援表达载体pBCG一2100中构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65。酶切鉴定、pcR和测序分析结果表

3、明，所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白65DNA片段与报道结果完全一致，重组体的连接方向正确，阅读框与预期完全一致。分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65构建成功。SDS—PAGE电泳结果表明，结核分支杆菌热休克蛋白65KD能在BCG体内表达，并且其表达量有显著的提高。通过Western-blot证实所产生的蜃白能与结核分支杆菌热休克蛋白65KD的抗体发生特异性的结合。≯结论：成功构建了分泌型原核穿梭表达载体pBCG—sP，结核分支杆菌热休克蛋白65KD基因通过此载体在BCG中能高效表达，并且表达的HSP65具有生物学活

4、性。人结核杆菌HSP65重组BCG疫苗构建成功。关键词：休克蛋白嘟；Ic争、重组BCG华中科技大学同济医学院硕士学位论文Abstractobjective：ToconstructasecretingshuttleprokaryoticexpressingplasmidthatcansurvivalinE．coliandMycobacterium．ToinsertthewholeDNAsequenceofheatshockprotein65thatcomesfromhumanMycobacteriumtuberculosiSintot

5、hevectorandtotranfertheplasmidintoMycobacterialsmegmatiSandBCGtoconstructrecombinantBCGvaccinethatholdstheHSP65DNAsequenceofhumanMycobacteriumtuberculOSiSbyelectroporationandtomakeabaseforournextresearchwork．Methods：Signalpeptidethatcomesfromantigen85BWaSamplifledfromB

6、CGgenomebyPCRandthewholeheatshockprotein65DNAsequenceofhumanMycobacteriumtuberculosiSwasamplifiedfromthep删SP65plasmidbyPCR．TheDNAsequencesofsignalpeptideweredigestedbyBamHIandNsiI．TheDNAsequencesofheatshockprotein65weredigestedbyKpnlandNsiI．Atthesametime．theplasmidsofs

7、huttleprokaryoticexpressingplasmidpBCG一2100werepropagatedbythethousandsandweredigestedbyKpnlandBamnl．ByDNArecombinationtechnology，asecretingshuttleprokaryoticexpressingplasmid(pBCG—SP．．HSP65)wasconstructed．TheplasmidwastransferredintoBCGandMvcobacterialsmegmatiSbyelect

8、roporation．Afteritwasinducedbyheat，weobservedtheexpressingefficiencyofheatshockprotein65ofhumanMycobacteriumtuberculo