《guo分离技术》PPT课件

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1、第五章固相析出分离法通过改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法结晶法2第一节盐析法(saltprecipitation)定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高，要除盐3两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小4一、基本原理5原理形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排

2、斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。6在盐析区，符合公式logS=-KsS——蛋白质溶解度，g/L；—盐离子强度,Ci——i离子浓度，mol/L；Zi——i离子化合价；——常数,为纵坐标上的截距;Ks——盐析常数。7、KS为纵坐标上的截距，是外推截距，与无机盐种类无关。KS是盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。两种类型：（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度

3、进行盐析，称作β盐析法。8（一）、无机盐的种类盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+盐析用盐常用硫酸铵9二、影响盐析的因素(二）溶质（蛋白质等）种类的影响10盐析分布曲线11（三）蛋白质浓度的影响12蛋白质浓度提高，盐用量减少。碳氧肌红蛋白（四）温度的影响13温度的变化会影响值在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反（五）

4、pH的影响当溶液的pH在蛋白质等电点附近时，值最小。利用值最低点时pH的不同，可以分级沉淀蛋白质.14三、盐析操作（一）盐析用盐的浓度表示固体粉末硫酸铵饱和溶液常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度为4.1mol／L，定义它为100%饱和度.15（二）盐析方法和注意事项1、分部盐析法2、重复盐析法3、反抽提法一定的盐浓度下将目的蛋白夹带一定量的杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶液平衡，溶出其中的杂蛋白。16分部盐析法17反抽提法(RNA聚合酶)18注意事项“局部过浓

5、”温度（室温）分离方法19第二节有机溶剂沉淀(OrganicSolventPrecipitation)定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。201、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。21一、基本原理一些溶剂的介电常数22有机溶剂沉淀法优点：乙醇等有机溶剂易除去，产品更纯净；密度差较大，离心收集。缺点：容易使蛋白

6、质变性，操作常需低温，成本高，需防火防爆。23二、影响沉淀效果的因素（一）有机溶剂种类及用量常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）pH的影响许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低，溶液pH应在等电点附近，还须考虑蛋白质的稳定性。24（三）温度（低温沉淀）有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著地减小。（四）无机盐的含量低盐：有利于沉淀，还有保护蛋白质，防止变性。高盐：增大蛋白质在有机溶剂―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夹带盐。25多价阳离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度降低。

7、胰岛素精制：26（五）某些金属离子的助沉淀作用（六）样品浓度浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白质浓度0.5%～2%；粘多糖浓度1%～2%。27第三节其它沉淀方法一、等电点沉淀法对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。28胰岛素纯化：胰岛素pH8除去碱性杂蛋白pH3除去酸性杂蛋白金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的金属复合盐法；有机酸类复合盐沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等

8、）。29二、成盐沉淀法1．金属离子沉淀：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；2．生成有机酸类复合盐沉淀（1）丹宁即鞣酸（2）雷凡诺（3）三氯乙酸（TCA）30雷凡诺31猪心提取液洗脱液上清液上清细胞色素C沉淀（去除）32吸附人造沸石盐析45%饱和硫酸铵沉淀TCA透析猪心中提取细胞色素C的工艺三、亲和沉淀利用亲和反