广西三黄鸡抗马立克氏病相关基因筛选的研究

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2、鸡抗马立克景Jt相关

3、i日姊葺l的研究广西三黄鸡抗马立克氏病相关基因筛选的研究摘要马立克氏病(MD)是鸡的一种淋巴组织增生性疾病，对家禽业危害极大。开展广西三黄鸡抗MD相关基因筛选的研究，旨在确立相应的分子遗传学标记来促进三黄鸡的抗MD育种工作，以弥补传统的疫苗接种为主的MD防制手段的不足。至此，已完成如下工作：应用广西MDV-1强毒分离株YL040920／C6对7日龄46羽普通霞烟鸡(分两组：A组未免疫，24羽、B组1日龄免疫HVT，22羽)和53羽MD抗性鸡(分两组：C组未免疫，27羽、D组1日龄

4、免疫HVT，26羽)分别进行攻毒试验，按常规分开隔离饲养，观察和记录鸡的死亡情况，至攻毒后(PC)12周结束试验。结果发现，A、B、C、D四组的肿瘤死亡率分别为66．67％、63．63％、44．44％和42．31％，肿瘤发生率分别为75．00％、72．72％、48．14％和46．15％，经t检验表明，MD抗性鸡的肿瘤死亡率显著低于普通霞烟鸡(P0．05)；对不同脏器肿瘤发生率的统计表明，心脏肿瘤发生率最高(43．5％)

5、，肝脏肿瘤次之(29％)，皮肤肿瘤再次之(10．6％)；采用血凝抑制(m)试验测定试验鸡血清鸡新城疫(ND)和禽流感(AI)抗体的效价，结果表明经过多次ND和舢疫苗免疫后，鸡体ND和赳抗体滴度一直没能达到预期水平，表明MDV感染霞烟鸡后产生了一定的免疫抑制作用。攻毒前后共计五次无菌采集并分离鸡外周血淋巴白细胞(PBLs)，置于-80℃保存，为下一步研究准备材料。利用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)分析的方法，对MDV攻毒后抗性存在差异的112份霞烟鸡PBLs生长激素基因第四内含子(Gill)的PCR扩增产物

6、，采用限制性内切酶SacI和Msp1分别进行限制-性片段长度多态·陛检测。结果发现仅有1个SacI酶切位点存在于Gill上，不具备多态性，而在GHl上存在2个MspI酶切位点，形成6种基因型分别为：AA、AB、AC、BB、BC和CC。ME)抗性鸡中AA型所占比例最高(50％)，BB、CC型为(O％)，在普通霞烟鸡中BB、CC型分别为(9．26％和1．85％)。经过卡方独立性检验表明，6种基因型在MD抗。陛鸡和普通霞烟鸡中的分布差异并不显著(P<0．05)。MD抗性鸡基因纯合广西大尊啊IE士掣啦论文．I-．-圈+三，}鸡抗马j-J‘最

7、庸相关

8、i囡婶嗣}的习F兜度高于普通霞烟鸡，在杂合度、有效等位基因数及多态信息含量遗传指标上均低于普通霞烟鸡，说明了我们培育的MD抗性鸡在种群上经过了15年后仍保持了较好的遗传稳定性。用建立的逆转录酶一聚合酶链式反应(RT．PCR)技术对MD抗性存在差异的霞烟鸡个体(其中MD抗性鸡11羽，代号分别为K7、K13、K16、Y30、A3、C12、C13、C22、D2、D16；易感鸡3羽，代号分别为A22、Y12、Y25)分别进行B．Fala2基因的扩增并测定其核苷酸序列，对所获得的序列在GeneBank数据库进行BLAST分析与比较。结

9、果发现，抗性个体D2、D16核苷酸序列结果与B2MD中等抗性的单倍型的同源性分别高达98．7％和99．4％；抗性个体C22、K16、Y30三者间序列的同源性也分别高达99．2％、99．O％、99．8％，基于同一单倍型具有相同或相似的B-Fal以基因序列这一观点，可以认为MD抗性鸡D2、D16与C22、K16、Y30可能分别属于两个具有MD抗性的单倍型。14羽MD抗性差异鸡的B-Fala2基因核苷酸同源性在91％～99．8％，说明此基因区域碱基替代还是非常频繁，呈现出丰富的多态性。另外，本次实验中所测定的14羽霞烟鸡B-Fala2基因

10、均属于四．FⅣ类等位基因。应用建立的逆转录酶～聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对霞烟鸡B．Fa2a3基因进行体外扩增，对目的基因进行TA克隆，经HindIII、EcoRI双酶切和测序鉴定后，将目的基因片段成功定向亚克隆于pSP72质粒T7启动子下游的多克隆位点，经过PCR和HindIII、EcoRI双酶切鉴定，采用HindIII单酶切rpSP72-B．Fa2a3重组质粒得到线性化转录模板DNA，在体外以T7RNA聚合酶转录合成，成功制备了用于进行核糖核酸酶保护实验(Ⅺ)A)的B-Fa2a3反义RNA探针；采用核糖核酸酶保护实验技术

11、对MD抗性与普通霞烟鸡进行B-Fa2a3基因的mRNA定量表达测定，结果显示MD抗-陛鸡的B-Fa2a3基因表达水平比普通霞烟鸡表达低。本研究的结果表明，m抗性鸡与易感鸡在B-Fa2a3基因的表达上存在明显差异，从而可以初步的把B-F