RNA干扰技术对A549细胞表皮生长因子受体（EGFR）基因抑制作用的实验研究

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1、摘要目的：利用RNA干扰技术，观察携带表皮生长因子受体(EGFR)同源基因的重组质粒稳定转染非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549细胞后对细胞表皮生长因子受体mRNA和蛋白质表达水平变化的影响；同时筛选出干扰效果较好的重组质粒，为进一步研究稳定转染后的单克隆细胞生物学特性做好准备。方法：根据RNA干扰原理，体外设计并合成4条靶向EGFR特异性干扰片段，即h—EGFRl、h-EGFR2、h-EGFR3、h-EGFR4，以pGensil-1为载体，分别构建重组质粒pGensil一1一EGFR—l、pGens

2、il—1一EGFR一2、pGensil一1一EGFR一3、pGensi卜卜EGFR一4。分别以Lipofectamine2000介导转染肺腺癌细胞株A549细胞，经G418筛选后挑选出稳定转染的单克隆细胞。将所挑选出的单克隆细胞大量培养后采用RT-PCR和Westernblot技术分别检测EGFR基因mRNA的转录及EGFR基因蛋白质翻译水平，并计算抑制率。结果：在挑选出稳定表达的单克隆细胞后，实验组pGensil-1-EGFR-1与未转染组相比EGFR表达水平无明显降低(P>O．05)，实验组pGens

3、il一卜EGFR一2、pGensi卜卜EGFR一3、pGensi卜卜EGFR一4与未转染组相比EGFR基因mRNA和蛋白质的表达水平均有明显降低(P(O．05)，mRNA水平干扰效率分别为27．6％，45．8％，51．7％，pGensi卜卜EGFR一2组与pGensi卜卜EGFR-4组相比有统计学意义(P

4、学意义(P)O．05)。空白对照组及阴性对照组与未转染组相比EGFR基因mRNA和蛋白质的表达水平无明显差异(P>O．05)。结论：利用RNA干扰技术，将4个携带表皮生长因子受体同源mRNA的重组质粒稳定转染至肺腺癌细胞A549后，其中3个能有效抑制A549细胞EGFRmRNA及EGFR摘要蛋白质的表达，提示RNA干扰技术能影响A549细胞中EGFR基因的功能；同时本实验也筛选干扰效果较好pGensi卜卜EGFR一3组与pGensi1-1-EGFR-4组两个实验组，为进一步研究携带表皮生长因子受体同源mR

5、NA的重组质粒稳定转染至肺腺癌细胞A549细胞后对A549细胞生物学影响做好准备。关键词：表皮生长因子受体；RNA干扰；非小细胞肺癌；基因治疗111AbstractABSTRACTObjectiveUsingRNAinterferencetechnique，observetheeffectofrecombinantplasmidcarryEGFRhomologousgeneontheexpressionofEGFRmRNAandEGFRproteinafteritbetransfectedtohumanl

6、ungCanCercellA549cell；atthesametime，wepickouttherecombinantplasmidwhichhavethebestinterferenceeffect，pavethewayforfurtherresearch011thebionomicsofthestabletransactedmonoclonecells．MethodAccordingtotheprincipleofRNAi，wedesignandsynthesizefourstripsofinterf

7、erencingfragmenttargetingEGFRgene：h—EGFR1、h—EGFR2、h-EGFR3、h—EGFR4，thenusepGensil·1asvector,constructtherecombinantplasmidpGensil-1一EGFR—l、pGensil—l-EGFR·2、pGensil—l—EGFR一3、pGensil-l-EGFR-4respectively．therecombinantplasmidwastransfectedintohumanlungcancel

8、"A549celllinemediatedbyLipofectamine2000，ThenthetransactedcellswereselectedwithG418andpickoutthestabletransfectedmonoclonecells．Aftercollectandculturethem，identifythetranscriptionandexpressionofEGFRbyl订一PCRandWester