水稻编码病程相关蛋白PR4和葡聚糖酶基因的克隆与鉴定

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1、浙江大学博士学位论文水稻编码病程相关蛋白PR-4和葡聚糖酶基因的克隆与鉴定姓名：朱廷恒申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：郑重2003.5.1摘要病原物的侵染或某些化学诱导剂的处理都会激活植物自身的抗病防卫反应。植物防卫反应中，病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins，PRproteins)的大量表达是一个显著特征。研究表明，PR基因的表达水平和抗病性之间紧密相关，有些PR蛋白在体外就有抗菌活性并且转PR蛋白基因的植物能提高抗病性。因此，PR蛋白基因的表达常作为分子水平上抗病反应的标志。化学诱导剂苯并噻二唑(b

2、enzothiadiazola，BTH)可诱导水稻产生系统获得抗性(systemicaquiredresistance，SAR)，提高对稻瘟病和白叶枯病等的抗病性。本文报道了水稻中受BTH诱导表达的两个病程相关蛋白基因伪PR一和和OsGlu的克隆和鉴定。从水稻受BTH诱导表达的差减杂交eDNA文库中，选择一个预测编码PR．4蛋白的差别表达克隆bntm．n18，以水稻受BTH诱导表达的全长eDNA文库DNA为模板，以基因特异引物和载体通用引物，通过PCR克隆了OsPR．4a的cDNA的缺失端。根据已知序列和克隆的缺失端序列拚接出OsPR．4a的全长e

3、DNA。OsPR．和全长cDNA为739bp，预测编码一个有151个氨基酸组成的蛋白，推测的分子量和等电点分别为16．47kD和4．42。从等电点看，OsPR．4a为一酸性蛋白。同源性分析表明。推测的OsPR-4a蛋白与已知的其他植物PR．4类蛋白在氨基酸水平上有大于60％的一致性。其中与大麦的PR．4蛋白相似性最离，达83％。OsPR-4a具有一个主要的结构域Barwindomain，属于Barwin家族。预测OsPR．4a蛋白N端的前25个氨基酸可能为信号肽并负责蛋白的胞外分泌。它与Barwin家族蛋白序列的一个显著特征是有6个保守的半胱氨酸，

4、并能形成3个二硫键。根据OsPR．4a基因eDNA的非编码区序列设计引物对，经PCR扩增了其基因组序列，发现有一个944bp的内含子。Sourthern分析表明，OsPR．4a以单拷贝存在于水稻基因组。以Northernblot分析比较了供试的水稻抗病和感病近等基因系在稻瘟菌接种后OsPR．4a表达的差异。在不亲和互作中，接种36h检测到OsPR．4a的表达；而亲和性互作在供试时间内没有检测到表达。对水稻稻瘟病感病品种幼茁在0．3mmol／LBTH处理后24h作Northernblot分析，检测到OsPR．4a表达，而水处理对照在48h内未检测到表

5、达。以RT-PCR检测OsPR．4a在水稻SAR中的表达动态，结果表明：水稻感病品种幼苗，在稻瘟菌接种后36hOsPR一4a表达量最高，72h略有降低；在0．3mmol／LBTH处理3d后接种稻瘟菌，接种36h后OsPR一4口表达量升高，并持续到72h。以上结果表明，水稻OsPR．4a基因能被SAR诱发剂BTH和稻瘟病菌的侵染诱导表达，而且在水稻受BTH诱导处理后，稻瘟病菌的挑战接种能进一步强化该基因的表达。克隆的水稻伽P月一4d基因在大肠杆菌中得到了表达，纯化的表达蛋白在体外对水稻稻瘟菌(Magnaporthegrisea)和纹枯菌(Rhizoc

6、toniasolani)的生长都有一定的抑制作用。在抑菌实验中，对抑菌圈边缘的菌丝形态进行显微观察后发现，与正常菌丝相比，稻瘟病菌和纹枯病菌的菌丝有畸形和不规则扭曲。用一对根据OsPR．4a基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到OsPR．4a基因上游2257bp的启动子序列。用PLACE软件分析顺式作用元件，发现OsPR．4a基因起始密码子上游1．5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关的顺式作用元件，如W盒、PAL-boxA、GT-I结合序列、Dof结合序列和MybStl元件等。将OsPR．4a基因启动子区域及其5’部

7、分缺失构件与gus报道基因相连，并克隆进pCAMBIAl391z载体中，用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR．4a基因表达中的功能。本研究还从水稻受BTH诱导表达的差减杂交eDNA文库中，选择一个预测编码13．I，3-葡聚糖酶的差别表达克隆bihn．n10，以水稻受BTH诱导表达的全长eDNA文库DNA为模板，以基因特异引物和载体通用引物，通过PCR克隆了OsGlu的5’缺失端。用已知序列和Genebank搜索的该基因EST序列拚接出OsGlu的全长cDNA。OsGlu的全长eDNA为2034bp，预测的ORF编码一个有470个氨萋酸组

8、成的蛋白，推测的分子鬃和等电点分别为50．3kD和5．77。同源性分析表明，推测的OsGlu蛋白与已知的其他植物13．1，