抗水稻纹枯病细菌拮抗物质及菌株基因突变的研究

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1、浙江大学硕士学位论文抗水稻纹枯病细菌拮抗物质及菌株基因突变的研究姓名：何青芳申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：陈卫良2002.5.1致谢在三年的硕士生学习生涯。p，导师陈卫良副教授为我的学习和论文完成作出了悉心指导，论文的选题、研究、撰写和修改都凝聚了导师的大量心血。导师丰富扎实的专业知识、勤奋严谨的治学态度、豁达平和的处世作风，使我不论在学习、工作和生活中都获益匪浅。谨此致以由衷的敬意和深深的感谢!浙江大学测试中心马志超副教授在拮抗物质的分离纯化和分析方面给予了大力帮助；李德葆教授、林福呈老师、王政逸老师在

2、不同方面给予了热情关怀；李大勇、杨中华同学在m问防治试验中提供了竭力帮助，在此一并致谢。廖乾生、李靖、黄晓躁、于翠、邵伯飞、王旭东、朱洁同学以及生物技术研究所的其他同学在我需要的时候都热情地给予了支持和帮助，在此向他们表示我的谢意!同时要感谢生物技术研究所的各位老师的关心和鼓励!最后，我要感谢我的家人，没有他们一如既往的无私关爱和支持我无以顺利并愉快地完成学业!何青芳2002年5月*Ⅱ^掌m±掌m*X抗水稻纹枯病细菌拮抗物质及菌株基因突变的研究摘要拮抗细菌菌株BacillussubtilisA30分离自水稻叶围。平皿测

3、试表明BacillussubtilisA30对多种植物病原菌，如病原真菌水稻纹桔病菌(Rhizoctoniasolani)、稻瘟病菌(Magnapor／hegrisea)等，病原细菌稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv．oryzae)等有强烈抑制作用。对该菌株的生长曲线及活性曲线进行分析，可知当细菌生长到对数生长中期时(OD600约为3．5)，拮抗活性丌始被检测出：在细菌生长进入稳定生长期后，拮抗活性达到最大，随后趋于稳定。／—<将拮抗菌A30菌株接种于LB液体培养基中，3TC下培养26小时，然后800

4、讼-pm离心20min去菌体，所得的去菌培养液用40％的硫酸铵沉淀过夜后12000rpm离心20min。将得到的沉淀用磷酸缓冲液悬浮，悬浮液离心去杂后通过FPLC疏水色谱和HPLC反相色谱进行分离纯化，最后纯化得到一种拈抗物质P1。经LC．ESI．MS质谱初步判断其分子量为1476．7Da。PI物质经酸处理后活性有部分降低，对碱稳定：经120。C高温处理30rain仍保持活性；同时该物质对蛋白酶K和胰蛋白酶以及乙醇、异丙醇、乙腈等有机溶剂具有稳定性。另外，Pl的茚三酮反应为阴性，但经酸水解后，茚三酮反应和双缩脲反应呈阳

5、性。根据以上结果推测它可能为⋯种环肽，或者为含有非氨基酸组分的肽类化合物。但拮抗菌A30菌株去菌培养液经40％的硫酸铵沉淀后所得的悬浮液通过30KDa分子量截流管截流试验发现，拮抗物质可被截流管截流，由此分析其分子量应大于30KDa，这可能是因为拮抗物质与某种大分子结合造成的。用含Tn917转座子的pTVI-OK质粒转化A30菌株感受态细胞，在红霉素和卡那霉素双抗培养基上筛选获得6个转化子，经质粒检测发现这六株转化子均含有质粒。利用pTVl·OK质粒含有温度敏感基因的特点，通过43"Ci宦i*4大掌硕女掌位论文擅晏温处

6、理和红霉素／卡那霉素培养基筛选，获得一批对卡那霉素敏感(丧失质粒)但对红臻素有抗性(转座子Tn917插入染色体DNA)的突变株。经抽样活性检测发现这些突变株丧火了拈抗活性。另外，用一系列浓度梯度递增的利福平诱导得到的A30抗利福平突变株，其升i仪具有与野生株相似的形态，还表现出与野生株相近的拮抗活性。水稻纹枯病菌菌丝块经拮抗细菌A30菌株的去菌培养液处理后，在滤纸上生长很缓慢，且有纠集状白色颗粒(菌丝纠集体)出现；而对照菌丝块在滤纸上生长较快，菌丝舒展，无纠集现象。通过光镜观察，前者的菌丝有生长扭曲，分枝增多、缩短，菌

7、丝明显变细等异常形态学变化；而对照则生长J下常，菌丝粗壮。同时，研究发现浸过拮抗细菌A30菌株去菌培养液的菌核萌发率只有24％，菌丝稀疏、细弱；对照菌核萌发率高达86％，菌丝浓密、粗壮。经水稻叶片离体试验，用A30去菌发酵液浸过的水稻纹枯病菌菌丝块比正常生长的水稻纹枯病菌菌丝块侵染水稻叶片的能力低；形成的病斑数量、关键词：水稻纹枯病；拮抗细菌；拮抗物质；纯化；理化性质＼—利福平吗防病作用堂兰查竺竺圭兰竺竺苎————————————————!

8、_!．一TheAntagonisticSubstanceProducedbyA

9、30StraintoRhizoctoniasolaniandtheGeneMutagenesisAnalysisAbstractAntagonisticstrainBacillussubtilisA30wasisolatedfromthephyllosphereofrice．Itshowedstrongantagonisticac