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1、中华人民共和国国家标准GB5009.274—2016食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布国家食品药品监督管理总局GB5009.274—2016前言本标准代替SN/T3038—2011《出口海产品中西加毒素的检测小鼠生物法》和SN/T3869—2014《出口水产品中雪卡毒素的测定》。本标准与SN/T3038—2011和SN/T3869—2014相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定”;———保留小鼠生物法为第一法,增加液相色谱-串联质谱法为第二法。ⅠGB
2、5009.274—2016食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定1范围本标准规定了水产品中西加毒素的测定方法。本标准适用于水产品可食部分中西加毒素的测定。第一法小鼠生物法2原理用丙酮提取水产品中西加毒素,提取物经减压蒸干后,再以1%吐温-60生理盐水为分散介质,制备西加毒素-1%吐温-60生理盐水混悬液,将该混悬液注射入小鼠腹腔,观察小鼠存活情况,根据西加毒素致小鼠死亡时间和鼠单位的关系表查出对应的鼠单位,并按小鼠体重校正鼠单位,计算确定西加毒素含量(鼠单位毒力)。3试剂和材料除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1吐温60(C64H1
3、26O26)。3.1.2苦味酸[HO-C6H2(NO2)3]。3.1.3丙酮(CH3COCH3)。3.1.4甲醇(CH3OH)。3.1.5正己烷(C6H14)。3.1.6乙醇(CH3CH2OH)。3.1.7乙醚(CH3OCH3)。3.1.8氯仿(CHCl3)。3.1.9次氯酸钠(NaClO)。3.1.10生理盐水。3.2试剂配制3.2.1次氯酸钠溶液(5%):称取次氯酸钠50g,用9950mL水溶解,搅拌使次氯酸钠充分溶解。3.2.2甲醇溶液(90%):量取100mL甲醇,加入900mL水,混匀。3.2.3乙醇溶液(25%):量取250mL甲醇,加入750mL水,混匀。3.2.4氯仿
4、-甲醇溶液(3+97):将氯仿与甲醇按体积比为3∶97混合均匀。3.2.51%吐温60-生理盐水:用生理盐水将吐温60稀释为吐温60含量为1%的溶液。1GB5009.274—20163.3标准品太平洋西加毒素-1(P-CTX-1,C60H88O19):纯度≥90%。3.4材料小鼠:昆明系封闭群清洁级(CL)或无特定病原菌级(SPF),且体重为18g~22g的健康雄性小鼠。4仪器和设备4.1电子天平:感量为0.001g。4.2均质器。4.3恒温水浴箱。4.4旋转蒸发仪。4.5氮气浓缩仪。5分析步骤5.1试样制备水产品取其可食部分(去骨),切成小块,制成肉糜。于-18℃以下保存。5.2试
5、样提取取试样200g置于塑料袋内,于70℃水浴15min。取出冷却后,加丙酮400mL,均质10min,用布氏漏斗抽滤并收集滤液。肉渣再重复萃取两次。合并滤液,于55℃旋转蒸发浓缩至近干。加入100mL甲醇溶液(90%)溶解,转移至500mL分液漏斗中,再加入100mL正己烷,充分振荡萃取,静置约30min以上,待分层完全,弃去上层正己烷层,收集下层甲醇溶液层。再加入100mL正己烷重复萃取一次。将下层的甲醇溶液于55℃旋转蒸发至干,以100mL乙醇溶液(25%)溶解,并转移至分液漏斗中,加入100mL乙醚充分振荡萃取,静置10min以上,待分层完全,收集上层乙醚层。下层溶液再用乙醚
6、萃取两次。合并乙醚萃取液,于40℃旋转蒸发至近干。浓缩物用5mL氯仿-甲醇溶液(3+97)溶解并转移至刻度试管中,于45℃用氮气浓缩至干,用1%吐温60-生理盐水定容至2mL,充分振荡,制成均匀西加毒素-1%吐温60-生理盐水混悬液。0.5mL该混悬液相当于50g试样。以此混悬液进行小鼠实验。注:为避免毒素的危害,应戴手套进行操作,用过的器材应在次氯酸钠溶液(5%)中浸泡1h以上,以使毒素分解。5.3小鼠试验5.3.1实验动物的饲养小鼠在通风、透光、清洁的室内环境饲养,实验期间正常供给标准啮齿类动物食物和饮水。5.3.2小鼠试验将小鼠随机分为试验组、溶剂对照组、空白对照组3组,每组3
7、只小鼠,每只小鼠称重(精确至0.5g),并记录体重。用染色法(如3%~5%苦味酸溶液或其他染色剂)做好编号。5.3.2.1试验组每只试验组小鼠腹腔注射0.5mL试样提取液。若注射时注射液溢出,须将该只小鼠弃去,并重新2GB5009.274—2016注射一只小鼠。5.3.2.2溶剂对照组每只溶剂对照组小鼠腹腔注射0.5mL1%吐温60-生理盐水,以排除吐温60-生理盐水可能产生的影响。5.3.2.3空白对照组每只空白对照组小鼠不进行腹腔注射,与实验组和溶剂对
