毕业论文-中华绒螯蟹（Eriocheir+sinensis）精子低温保存的研究

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1、Y8953272006届研究生硕士学位论文学校代码：1026尘学号：YS03261024荦象吁苑天擎中华绒螯蟹(删Dc死P打s扬P咒s括)精子低温保存的研究院系：生佥科堂堂瞳专业：动塑堂研究方向：丞生生堑生殖生堡指导教师：L登熬握硕士研究生：睦壅堡2006年6月完成警量皂皂莰搬(、EriocheirSinensiS、)精子低温保存的研究中文摘要1、保存液及保存条件对中华绒螯蟹精予存活率的影响在低温(4℃)下对中华绒螯蟹精子进行体外保存研究，探讨了六种保存液对精子体外保存中存活率的影响。以伊红染色法检测样品活精子率，并结合保存液中的精子密度的变化来评价保存液的保存效果。结果显示，六种保存液中海

2、水等渗Kcl溶液和海水等渗葡萄糖溶液的保存效果最差，保存2d后精子即全部死亡，而两种无钙离子人工海水的保存效果较好，其中以无钙离子人工海水II的效果尤佳，其保存6d后的活精子率达92。19％，精子密度亦保持较高水平；表明无钙离子人工海水II是中华绒螫蟹精子短期体外保存的理想保存液。此外，在对该蟹精子体外保存过程中的精子密度、保存液pH值和渗透压条件的研究中发现，以无钙离子人工海水II作保存液，不同精子密度的保存效果差异显著，其中以106～107个／『IlL的保存密度效果最好，在保存2d后其活精子率仍保持在95％以上；而保存液pH条件的研究发现，在pH7～lO的范围内，保存15d后的活精子率均

3、在90％以上；在以NaCl配制的渗透压范围为500～1000mOsmol／kg地O的10个梯度保存液中，以750～850mOsmol／kgH。O的保存液保存效果最好，该条件下保存15d后其活精子率仍在75％以上：以上结果证实，中华绒螫蟹精于适宜的保存条件为：精子密度为106～107个／mL，渗透压范围为750～850mOsmol／kgH20，pH范围为pH7一lO。2、ca斗、M92+、K+对河蟹精子体外保存效果的影响以ASw(人工海水)为基础，在低温(4℃)下对河蟹精予进行体外保存的研究，探讨ASW中几种阳离子成分对河蟹精子保存质量的影响，分别配制了人工海水(Asw)，2倍钙离子人工海水(

4、2×ca2+．Asw)，无镁离子人工海水(M92+队sw)，无钾离子人工海水(K+FAsw)，无钙离子人工海水(Ca2+FASw)，以伊红染色法检测样品活精子率，并结合保存液中的精子密度的变化来评价保存液的保存效果。扫描电镜和透射电镜辅助观察保存后的精子的超微结构。在此基础上重点探讨不同含量的M矿+和ca”对精子质量的影响。结果表明K—FAsw、Asw及2×Ca”-ASW中培养的精子均发生顶体反应，不适宜用来保存精子。Mg“FASW和c矿FASw中培养的精子未发生顶体反应，精子保存完整。在无K+存在的情况下，保存液中C扩、Mg”的存在与否将对精子的保存起关键作用。ASw中的Ca”可以引起精子

5、的损伤，且在一定范围内，随着Ca”浓度的增加，顶体反应率提高，损伤增加，存活率逐次下降。无M矿人工海水之所以具有较好的保存效果，可能与其Mg”的缺乏而导致能量转移的受阻，同时限制了Ca2+进入精子细胞内，避免了因ca2+进入而诱发的顶体反应发生有关。3、中华绒螯蟹精子体外冷冻保存的研究选取二龄成熟的中华绒螯蟹，取其精荚，胰蛋白酶消化法获得精子，采用冷冻保护剂DMS0及甘油不同浓度比例及组合下对其精子进行体外冷冻保存，依次分别设置实验组l～10组，细胞冻存管中精子的浓度为107个／ml，液氮中保存过夜8hrs以上，染色法检测冷冻后精子的存活率，单细胞凝胶电泳检测冷冻对精子DNA的损伤，综合评价

6、保存效果，结果显示甘油比DMsO更有利于精予的冷冻保存，随着浓度的增加，DMS0对精子的损伤增加；IO％的甘油精子冷冻保存效果最佳。此外对预冷时间的长短对精子冷冻保存效果影响进行了研究，设置实验组1—5组，冷冻前的预冷时间分别为5—40分钟，10％甘油作为冷冻保护剂，其它保存与检测的方法同上，结果显示预冷时间的长短对精子冷冻保存效果的影响显著：当预冷时间低于20min时，冷冻后的精子多数死亡，存活率仅为5．90±2．47％，且DNA损伤明显，拖尾现象较严重，当预冷时间为30—40分钟时，冷冻后的精子的存活率明显增高，可达49．38±O．54％，DNA损伤相对不是很明显。因此本实验建议中华绒螯

7、蟹精子冷冻保存的预冷时间在30分钟以上。4、中华绒螯蟹雄性生殖系统中无机离子的分析采用PEA～300原子吸收分光光度仪测定如下Na、K、Ca、Cu、zn、Mg、~fn元素含量。选取二龄成熟的中华绒螯蟹，分别取其雄性生殖系统中的精巢、副性腺、前输精细管壁、后输精细管壁、贮精囊壁、精荚、精液。冷冻干燥后，称取其干重。采用湿式消解法处理样品(HNO。：Hcl0。=4：1)，PEA～300原子吸收分光光度仪分别测定N