三羟异黄酮对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制研究

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1、中文摘要三羟异黄酮对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制研究摘要目的：本研究采用人结肠癌细胞LOVO为靶细胞，观察1713．雌二醇(1713．estradiol，E2)、三羟异黄酮(Genistein，GEN)对细胞增殖、凋亡的影响；检测三羟异黄酮作用细胞前后bcl．2、caspase．3基因表达的改变，探讨雌激素受体介导的细胞死亡特征和作用机制。方法：(1)MTT比色法检测17B．雌二醇、三羟异黄酮对细胞的生长抑制作用。(2)倒置光显微镜观察细胞形态结构改变；Hoechst33342／PI双荧光染色，荧光显微镜观察细胞死

2、亡特征，区分凋亡细胞与坏死细胞。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡峰及周期变化(4)半定量RT-PCR法检测LOV0细胞雌激素受体mRNA表达及三羟异黄酮对凋亡相关基因bcl．2、caspase．3基因表达的影响。结果：(1)MTT比色法检测三羟异黄酮及17ljl．雌二醇对LOV0细胞增殖的影响，其结果显示两种药物均可抑制LOV0细胞增殖，当作用时间相同时增殖抑制率与浓度正相关，呈浓度依赖性，当药物浓度相同时增殖抑制率与作用时间正相关，呈时间依赖性。30Ilmol／L三羟异黄酮即可对LOV0细胞起到一定的增殖抑制作用，高浓度

3、三羟异黄酮(120nmol／L)对细胞有剧烈抑制作用，作用96小时后抑制率高达89．63％。低浓度的17B．雌二醇(10IImol／L)对LOV0细胞也有抑制作用，但与高浓度1713．雌二醇相比较其增殖抑中文摘要制作用明显降低，其抑制作用也呈现时间依赖性。(2)细胞形态学改变：光学显微镜观察：倒置光显微镜下，对照组LOVO细胞细胞数目均增多、贴壁状况良好、细胞多呈梭形或多角形、大小适中铺满整个视野，核仁清晰、可见核分裂相；60umol／L浓度的三羟异黄酮作用LOVO细胞48小时后与对照组比较细胞数目减少、贴壁状况不好，

4、形态不规则、排列紊乱且有较多漂浮细胞，细胞出现不同程度的皱缩及空泡、核质比率倒置、核分裂相减少，细胞密度下降，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞内可见多个折光性较强的圆形小泡样结构和细胞出芽样改变，细胞间失去正常接触抑制，细胞碎片增加、背景颗粒增多。60umol／L浓度的17B．雌二醇处理细胞后，细胞停止增殖，细胞出现肿胀、变圆，呈较典型坏死征象。荧光显微镜观察：对照组LOVO细胞大小基本一致，被Hoechst33342大量的正常活细胞细被染成蓝色，胞膜完整，细胞核结构正常；少量的死亡细胞被染成红色，细胞核结构正常。相反6

5、0umol／L三羟异黄酮干预的LOVO细．胞可见下列规律性的变化：作用24h后部分细胞可见凋亡细胞被染成蓝色，染色质高度浓缩、边缘化，凝集成明亮的团块，即凋亡小体，部分细胞形态不规则，细胞变小，并有核碎裂现象；一些细胞被染成红色，但可见明显的染色质凝集，即凋亡后继发死亡的细胞。给予不同浓度的1713．雌二醇后未见以上凋亡细胞形态改变，经作用时间延长后可见部分细胞肿胀，被PI染成红色荧光，细胞呈坏死形态。(3)流式细胞仪检测结果：三羟异黄酮组细胞于作用后48小时较对照组细胞出现了明显的细胞凋亡，在正常二倍体细胞的Go．G

6、l期前出现的亚二倍体峰即为凋亡峰AP；凋亡细胞百分比由中文摘要3．16％增加至37．5％。17B．雌二醇干预细胞后，细胞周期发生变化，G2／M期细胞比例明显增加，但无凋亡峰出现。(4)RT-PCR法检测LOVO细胞雌激素受体mRNA表达及三羟异黄酮对凋亡相关基因bel．2、caspase．3基因表达的影响：RT-PCR结果显示LOVO细胞中雌激素受体a表达微弱，而雌激素受体J2l呈强表达。三羟异黄酮对凋亡相关基因bcl．2、caspase．3mRNA表达的影响：RT-PCR结果显示不同浓度三羟异黄酮处理LOVO细胞后，

7、easpase．3表达较对照组增强，bCl．2表达呈浓度依赖性减弱。结论：(1)人结肠癌细胞系LOV0表达雌激素受体基因，但以雌激素受体B表达为主，雌激素受体Q仅有微弱表达。(2)三羟异黄酮可明显抑制LOV0细胞的生长及增殖，抑制作用呈现浓度一时间依赖性。三羟异黄酮对LOV0细胞的抑制作用，其机制包括：抑制细胞增殖、诱导凋亡、改变细胞周期，影响凋亡相关基因caspase一3、Bcl-2的表达。(3)17B一雌二醇可明显抑制LOV0细胞的生长增殖，呈浓度一时间依赖性，但17B一雌二醇无诱导LOV0细胞凋亡的作用，其抑制作

8、用可能与改变细胞周期有关。(4)三羟异黄酮与17B一雌二醇通过不同的作用机制抑制LOV0细胞的生长、增殖。三羟异黄酮的抗结肠癌机制可能通过非雌激素途径。关键词：人结肠癌细胞；17B一雌二醇；三羟异黄酮；细胞增殖；凋亡；caspase一3；bcl一2英文摘要EffectofGenisteinonGrowthandApoptosiso