水溶性CdTe量子点的制备及对大肠癌细胞的免疫成像研究

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1、·中文论著摘要·水溶性CdTe量子点的制备及对大肠癌细胞的免疫成像研究刖菁在生物医学研究领域，随着高灵敏度和高特异性探针技术的不断发展，有机荧光染料应用存在的局限性越来越明显，量子点则在很多方面具有显著的优越性。量子点(quantumdots，QDs)是指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米晶粒，粒径通常为1．10nm，一般为由第二族和第六族元素(CdTe，CdSe)，或第三族和第五族元素(InP,hAs)构成的化合物。作为一种新型荧光染料，具有诸多独特而优良的光学特性——连续而宽的激发光谱，且荧

2、光谱峰位置可通过改变QDs的粒径进行调控，便于进行多元荧光检测；发射光谱窄，可同时显现多种不同颜色而无重叠；Stokes位移大，能够避免发射谱与激发谱重叠，从而允许在低信号强度的情况下进行光谱学检测；抗光漂白能力强，而这种抗光漂白的高度光稳定性对于需要长时间成像的研究而言极为重要；光稳定性高，便于获得无背景干扰的荧光信号等优良的光物理特性；荧光产率高，强度强，单一量子点表现出的荧光亮度是有机荧光染料的10．20倍。因此，量子点在多个研究领域显示出其广泛的应用前景。将量子点标记在抗体上制备免疫荧光探针

3、，可特异性地识别细胞受体，进行细胞抗原的特异性检测。由于量子点独特的光学特性，将其标记抗体，引入免疫荧光成像研究，大大提高了特异性检测的灵敏度，且适用于多色成像与实时监测，这对生物医学的研究，尤其对高效进行肿瘤的早期检测具有重要意义。根据合成量子点时所采用溶剂的不同，高质量量子点合成方法主要可归结为两大类，一种方法是在高沸点的有机溶剂中利用前躯体热分解来合成，另一种是利用稳定剂在水溶液中直接合成。水相合成量子点本身具有水溶性与生物相容性，无需进行进一步的水溶性修饰即可直接与生物分子偶联。因此，本研究

4、采用水相合成方法以制备巯基乙酸包被的CdTe量子点。大肠癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第3位，建立有效的早期检测的方法，以实现早期诊断、早期治疗是提高患者生存率的关键。ND．1是以人大肠癌细胞系CCLl87为免疫原制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，已进行的近千例临床病理检测显示，该单抗对高中分化大肠癌组织具有特异性结合活性，并优于目前广泛采用的美国商业产品抗CEA单抗。其所识别的大肠癌肿瘤相关LEA(1argeexternalantigen，LEA)位于细胞膜表面，是一种与细胞分化、侵袭能力

5、相关的肿瘤抗原，在正常组织、非大肠癌及低分化大肠癌组织中，几乎不表达或表达率很低，在中高分化大肠癌组织中高度表达，对其检测有助于大肠癌的早期诊断，并可作为大肠癌恶性程度判断的参考指标。为此，本研究采用水相合成方法制备CdTe量子点，并将其与单克隆抗体ND．1偶联，制备大肠癌细胞相关抗原LEA的特异性荧光探针，实现对大肠癌细胞的高灵敏度检测，为大肠癌的早期诊断及成像研究提供新的方法和途径。材料与方法一、水溶性CdTe量子点的制备、纯化及表征l、水溶性CdTe量子点的制备在0℃无氧条件下合成NaHTe前

6、躯体，以前躯体为核心合成量子点溶液，并在140。C条件下加热不同时间以获得不同粒度的量子点。2、水溶性CdTe量子点的纯化上述反应制得的量子点以0．229m微孔滤膜过滤，以去除未反应完全的碲粉。超滤管离心超滤，以去除量子点溶液中过量的巯基乙酸。3、水溶性CdTe量子点的表征对量子点的紫外可见吸收光谱及荧光光谱进行检测，并根据荧光光谱谱峰估算出量子点的粒径；对140*c]Jl热195min制各的QD613进行TEM检测。二、单克隆抗体的制备、纯化与鉴定1、单克隆抗体BALB／C小鼠腹水的制备雌性BAL

7、B／C小鼠腹腔内接种分泌ND．1的杂交瘤细胞株IC2，每只小鼠注射0．5ml，细胞浓度为1-2x106／ml，10．20日后陆续于腹腔抽取腹水。22、小鼠腹水的分离与纯化腹水中加入CaCl2及离心去除蛋白纤维凝块，24h透析后经过HiTrapproteinG柱亲和层析纯化单克隆抗体。纯化后抗体经超滤调整至适宜温度及置换缓冲液为PBS，4"C备用或．70"C长期保存。SDS．PAGE鉴定单克隆抗体纯度。Bradford法测定蛋白质含量。3、单克隆抗体免疫活性的检测以纯化的单克隆抗体为一抗，羊抗小鼠FI

8、TC．IgG为二抗分别孵育CCLl87细胞和HeLa细胞，进行免疫荧光成像，以检测单克隆抗体ND．1的免疫活性。三、量子点与单克隆抗体偶联产物(QD61s-ND．1)的制备与纯化1、量子点与单克隆抗体ND．1的偶联采用不同的缓冲体系对量子点表面羧基的偶联活化条件进行考察。采用EDAC连接法，使量子点QD613的巯基乙酸羧基基团．COOH与单克隆抗体ND．1末端的伯胺-NH2共价反应。2、偶联产物QD613小D．1的纯化采用SephacrylS-200凝胶进行凝胶过滤层