博莱霉素致肺纤维化小鼠肺组织中P65、αSMA的表达及意义

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1、●英文缩略语9中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名．_堑丝日期：加p．-1"．加中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，

2、即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：ⅫP．-t．加·中文论著摘要·博莱霉素致肺纤维化小鼠肺组织中P65、Q-SMA的表达及意义-止．!当刖吾间质性肺疾病(ILD)是由200余种疾病组成的

3、一类疾病，他们在临床表现、实验室和病理学改变上具有一定共同特点，但又有各自不同的特征。肺纤维化的典型病理学过程为肺泡上皮损伤，炎性细胞聚集，成纤维细胞过度增殖，细胞外基质沉积，成纤维细胞增殖灶，以及蜂窝肺的形成。博莱霉素可导致啮齿类动物急性肺损伤和肺纤维化，这一特点为研究肺间质纤维化提供了成熟的动物模型。核因子-KB(nuclearfactor-kappaB，NF—KB)是重要的转录因子，调节许多炎症性细胞因子的转录，P65是其重要的功能亚单位。研究显示，在BLM诱导的肺间质纤维化病理过程中，NF．KB的表达明显增强。成纤维细胞分化为

4、表达Q．平滑肌动蛋白的肌成纤维细胞在肺间质纤维化病理过程中具有重要作用。本实验以博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型为研究对象，应用免疫组织化学方法，旨在阐明NF．KBP65、Q．平滑肌动蛋白(a．SMA)在肺纤维化发生发展中的动态变化，揭示NF-KB活化与Q—SMA蛋白表达的相关性，研究NF—KB活化在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中的作用，从而探讨肺问质纤维化的发病机理，为其治疗提供新的治疗靶点和理论实验依据。材料与方法一、实验材料8周龄雌性C57BL／6小鼠(体重17～20克)，无特殊病原体SPF级(北京维通利华实验动物技术公司)，

5、寄养于中国医科大学附属盛京医院动物中心，博莱霉素A2(BLM--A2)15毫克／支(日本化药株式会社，批号：H20040205)，小鼠抗人NF．KBP65单克隆抗体，小鼠抗人a．SMA单克隆抗体(美国SantaCruz公司)，即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。二、实验动物模型的建立、分组与标本处理1、实验动物模型建立、分组将60只C57BL／6雌性小鼠随机分为实验组与对照组。所有实验小鼠均用10％水合氯醛(3rnl／kg)腹腔注射麻醉后，无菌手术暴露气管进行模型制作。实验组(BLM组)：50只，第

6、0天向每只小鼠气管内分别注射20u1含BLM·A2(5mg／kg)的无菌生理盐水。对照组：10只，第0天气管内注入生理盐水20ul。2、标本的采集与处理在实验的第1、3、7、14、28天对实验组取材，每次随机选取10只。第7、14天对对照组取材，每次随机选取5只。以腹腔主动脉放血法处死实验小鼠，留取肺组织。将左肺完整取出，放入4％多聚甲醛中固定3h，常规石蜡包埋，制成4um厚的组织切片。三、肺组织常规病理分析1、常规病理肺组织经不同浓度酒精常规脱蜡至水，行HE染色和Masson染色。2、肺泡炎症及纤维化程度的组织病理学评分方法依照Sz

7、apiel法确定肺泡炎症及纤维化程度，两者均分4级，分别记为1、2、3、4分。四、实验方法及检测指标应用免疫组织化学技术(SP法)，检测肺组织内NF．KBP65、Q．SMA蛋白的定位及表达。五、统计学分析应用SPSSl3．0统计软件进行分析，所有数据均以均数±标准差表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，组内不同时间点比较采用单因素方差分析，单因素相关分析采用spearson相关分析法，P<0．05为差异有统计学意义。2实验结果一、肺组织的病理变化肺组织病理HE染色显示，对照组未见明显的炎症细胞及大片实变改变。实验组小鼠经气管注射B

8、LM后第3天，可见肺泡壁略增宽，肺泡腔和肺间质内有炎性细胞渗出；第7天，肺泡间隔增厚，局部肺泡萎陷，肺泡腔内可见渗出改变，内有大量炎症细胞浸润；第14、28天肺泡炎开始消退，肺泡间隔明显增厚，大量肺泡萎陷，结构破坏，形成