分子生物学研究法（下）基因功能研究技术

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1、6分子生物学研究法（下）－－基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.2基因敲除技术6.3蛋白质和RNA相互作用技术6.4基因芯片及数据分析6.5利用酵母鉴定靶基因功能6.6其它分子生物学技术16.1基因表达研究技术6.1.3原位杂交技术（insituhybridization,ISH）原位杂交技术（insituhybridization,ISH）：用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。菌落原位杂交2荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是在已有的放

2、射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体或DNA上特异序列杂交，通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。3荧光原位杂交技术原理示意图4端粒DNA的荧光原位杂交56.1.4基因定点突变技术研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性及结合配体能力的影响。主要蛋白质结构与功能的关系。重叠延伸技术和大引物诱变法。6重叠延伸介导的定点诱变7大引物诱变法86.3蛋白质及RNA相互作用技术6.3.1酵

3、母单杂交系统酵母单杂交系统：是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。9酵母单杂交系统原理①将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞。③该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。酵母单杂交的基本原理10从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。116.3.2酵母双杂交系统（yeasttw

4、o-hybridsystem）酵母双杂交系统：用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用，也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。完整的真核生物转录调控因子具有2个可分隔开的结构域：DNA特异结合域（DNA-bindingdomain,BD）;转录激活域（transcriptionalactivationdomain,AD）一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有BD、AD，否则无法完成激活功能。12BD-XAD-Y共同表达于酵母细胞内AD、BD会形成完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达。如果2蛋白

5、能发生相互作用13酵母双杂交的基本原理示意图146.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET）FRET荧光能量转移有三个基本条件：①给体与受体在合适的距离（1～10nm）；②给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠；③给体与受体的偶极具有一定的空间取向。156.3.5RNAi技术及其应用RNAi（RNAinterference）技术：利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。16siRNA：小干扰RNAsmallinterferingRNA(siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸

6、），与mRNA的互补区发生碱基配对作用，阻遏其表达。具有这种作用的短小单链RNA称～。这种作用称RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。17siRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物（RNAinducedsilencingcomplex，RISC），RISC进而识别和siRNA具有完全互补序列的mRNA，特异的降解mRNA。18196.6其它分子生物学技术6.6.2噬菌体表面显示技术噬菌体溶原周期、溶菌周期表面显示（surfacedisplay）：是一种基因表达筛选技术。是将“诱饵”蛋白基因克隆在特定的表达载体中，使其以融合蛋白的形式显示在

7、噬菌体表面，直接用于捕获靶蛋白库中可与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。20重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。21THEEND!22