pcr技术发展和展望

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1、PCR技术的发展及展望摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来．基于常规PCR技术开发出了许多新的用途。综述了PCR技术的主要扩展。关键词：PCR技术1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Kh

2、orana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子

3、链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断[1]。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。1.PCR技术的扩展1.1AP-PCR技术1.1.1AP-PCR技术的定义、来源及特点AP-PCR(ArbitrarilyprimedPCR)技术[2]，是指在对所扩增基因顺序一无所知

4、的情况下．主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增l至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图,即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR技术由Williams等[3]于20世纪90年代建立．它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。1.1.2AP-PCR技术的应用AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离，Liang和Pardee[2]应用

5、AP-PCR技术对正常A31和肿瘤起源的BPA31细胞进行了鉴定，并分离得到了仅存在于正常细胞的N1及仅存在于肿瘤细胞的T1片段；(2)菌株鉴定，杨国玲等[3]采用AP-PCR技术对甲真菌病病原菌进行了快速鉴定；(3)遗传作图，Welsh等[2]成功地应用AP-PCR方法快速鉴定了重组鼠(C56BL/6J×DBA/2J)扩增多态性在染色体图谱中位置。1.2LP-PCR和彩色PCR1.2.1LP-PCR和彩色PCR的定义LP—PCR(LabelledprimersPCR)．即标记PCR，它是指利用同位素、

6、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，通过PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。彩色PCR(ColorComplementAssay)是指利用荧光染料标记引物的5’端，不同荧光(荧光染料TAMRA呈红色荧光，JOE和FAM呈绿色荧光,COUM呈蓝色荧光)标记的引物同时参加反应,经PCR反应扩增后，根据不同荧光的色泽来判断目标基因是否存在及扩增基因的类型[4]。1.2.2LP-PCR和彩色PCR的比较LP-PCR与彩色PCR由荧光PCR[5]那发展而来，彩色PCR是LP-PCR的一种。与常规PCR相比，L

7、P-PCR更为直观,其省去了限制性内切酶酶解及分子杂交等繁琐步骤，并且一次可以同时分析多种基因成分，但是LP-PCR只能对产物进行定性鉴定。与LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2种不同颜色的引物：一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照。但是在检测多点突变时，彩色PCR需用更多的色彩[4]。1.2.3LP-PCR和彩色PCR的应用LP-PCR和彩色PCR是常规PCR技术与标记技术相结合的产物，LP-PCR常被用于大量临床标本的基因诊断，同时可用于对PCR产物进行定性鉴定。彩色PCR常被用予检测

8、基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等，如被用于检测多突变点的遗传病[4]。1.3免疫PCR技术1.3.1免疫PCR技术的定义、来源及特点免疫PCR(immunopolymerasechainreaction，IM-PCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，它综合了同相免疫反应和PCR的特点。免疫PCR技术是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术[6]。与常