丹参酮Ⅰ调控人肝癌7721细胞凋亡机制的研究

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1、分类号:Q7学校代码：10697密级:公开学号：201520885丹参酮I调控人肝癌7721细胞凋亡机制的研究学科名称：生物化学与分子生物学作者：周少荷指导老师：陈超教授西北大学学位评定委员会二〇一八年六月StudyonApoptosisMechanismofHumanHepatocellularCarcinoma7721CellsInducedbyTanshinoneIAthesissubmittedtoNorthwestUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegree

2、ofMasterinBiochemistryandMolecularBiologyByZhoushaoheSupervisor:ChenchaoProfessorJune2018摘要摘要目的：肝癌是我国因癌症引发死亡的第三大杀手。目前针对其治疗方法包括手术疗法（肝切除、肝移植）和非手术疗法（介入疗法、放疗、化疗等），但研究表明大部分肝癌患者会出现术后癌症复发、单纯放化疗效果不明显、容易产生多药耐药、出现强烈药物不良反应等现象。所以临床上急需要寻找一些治疗效果好同时又能够有效降低患者不良反应的药物。我国作为中药发展、研究和应用领域的大国，已经

3、发现有很多天然药用植物的活性提取物具有良好的抗肿瘤疗效，其中丹参酮I就在近年来的报道中被指出抗癌作用明显且毒副作用较低，但其相关作用机制尚不清楚。本实验目的是以人肝癌7721细胞为对象，研究丹参酮I促使细胞凋亡的相关作用机制，为丹参酮I作为抗肿瘤药物进入临床应用提供前期理论和实验基础。方法：以不同浓度剂量丹参酮I刺激细胞，利用倒置显微镜检查细胞形态学变化，CCK8法对各组细胞活力值进行检测，RTCA法实时监测细胞活力变化，流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡及细胞内活性氧水平变化情况，同时将细胞用DAPI染色后通过荧光显微镜检测肝癌细胞凋亡情况

4、，应用蛋白免印迹法（WB）检测周期、凋亡及自噬相关蛋白的表达情况，最后再分别利用活性氧清除剂（NAC）和自噬特异性抑制剂（3-MA）预处理细胞后进行细胞活力及细胞凋亡方面的检测。结果：1.丹参酮I能显著抑制人肝癌7721细胞增殖，且呈现时间-剂量依赖性，在倒置显微镜下显示经药物刺激后癌细胞变圆且数量急剧减少。2.丹参酮I可以使人肝癌7721细胞中CyclineA1蛋白的表达量下降，P21的表达量上升，促使细胞被阻滞在S期。3.丹参酮I可以将细胞早期凋亡率由0.24%提高到8.98%，利用DAPI进行核染后随浓度增加荧光亮点数量显著增多，另外

5、可以使P-ERK蛋白表达降低，I摘要凋亡标志蛋白分子Caspase3和PRAP表达升高，提示药物可能通过细胞外信号调节激酶途径释放相关信号因子促使细胞发生凋亡。4.丹参酮I刺激癌细胞后可以引发细胞内ROS水平的提高，在加入ROS特异性清除剂NAC孵育，再利用药物刺激细胞后，细胞活力明显上升（P＜0.001）细胞凋亡率则显著降低（P＜0.001）。5.丹参酮I可以参与诱导细胞发生自噬，造成自噬标志蛋白LC3-I，LC3-II和Beclin1表达的升高及P62蛋白表达的降低；在利用自噬特异性抑制剂（3-MA）对自噬进行抑制后，细胞活力显著逐渐下

6、降（P＜0.01），细胞凋亡水平不断提高，提示丹参酮I的加入可能引发细胞内保护性自噬的发生，加入自噬抑制剂后则能够抑制癌细胞的生长。结论：丹参酮I对肝细胞癌具有明显的抗肿瘤活性，可以阻滞细胞周期、促使细胞发生凋亡，是一种潜在的肝癌治疗药物。丹参酮I促使肝癌细胞凋亡的机制可能是刺激癌细胞后通过引起细胞内活性氧水平的增加来有效抑制细胞外信号调节激酶活化，使p-ERK蛋白表达水平降低，同时激活caspase3等凋亡蛋白，进而导致细胞发生凋亡。另外，丹参酮I可以促进肝癌细胞发生保护性自噬，抑制自噬可以增强丹参酮I诱导的细胞凋亡效应，因此当利用药物联

7、合自噬特异性抑制剂使用时可以有效提高药物的抗肿瘤活性，从而进一步提高丹参酮I治疗肝细胞癌的临床疗效。关键词：丹参酮I，肝细胞癌，细胞周期，细胞凋亡，细胞自噬IIABSTRACTABSTRACTObjective:LivercanceristhethirdleadingcauseofcancerdeathsinChina.Thecurrenttreatmentoptionsincludesurgicaltherapy(liverresectionandlivertransplantation)andnon-surgicaltherapy(in

8、terventionaltherapy,radiotherapy,chemotherapy,etc.),butstudieshaveshownthatmostpatientswi